人参皂苷Rh1对哮喘模型小鼠炎症因子表达的抑制作用*

张春晶, 李淑艳, 赵容杰， 赵正林△

(齐齐哈尔医学院 1生物化学教研室， 2精神卫生学院， 黑龙江 齐齐哈尔 161006)

支气管哮喘(bronchial asthma，简称哮喘)，是一种常见的呼吸系统过敏性疾病，以气道高反应性和慢性炎症为特点，目前严重危害人体健康，发病率逐年增高。其主要生化和病理变化为整体和局部(呼吸系统)免疫炎症反应的紊乱，尤其是以嗜酸性粒细胞(eosinophil,EOS)、肥大细胞(mast cell)及其所分泌的炎症介质和细胞因子反应为主的气道非特异性炎症[1]。关于哮喘的发病机制不是很明确，但通过一系列研究发现，与辅助性T细胞(helper T-cell， Th)1与Th2细胞的异常分化与功能异常引起的继发性的炎症因子表达增多和免疫调节机制失调密切相关。人参是广泛利用的传统名药，已经分离出数十种有效单体成分，其中人参皂苷Rh1(ginsenoside Rh1)具有明显的抗肿瘤、抗炎症以及免疫调节作用，具有增强机体的免疫机能的作用，而且没有严重的不良反应，因此成为临床上常用的名贵药材之一[2-3]。人参皂苷Rh1具有抗哮喘作用，但其对哮喘的免疫学机制尚未有深入的研究。为了进一步考察人参皂苷Rh1对支气管哮喘是否具有缓解作用,本实验利用小鼠制作哮喘模型，观察了人参皂苷Rh1对血清和支气管肺泡冲洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中各种炎症因子的变化，肺组织中转化生长因子(transforming growth factor, TGF)-β1的表达和对肺组织病理学变化的影响。

材 料 和 方 法

1 主要药品与试剂

人参皂苷Rh1购于韩国岭南药业公司，纯度>98%； 卵清蛋白(ovalbumin，OVA)和氢氧化铝(分析纯) 购自Sigma；白细胞介素(interleukin, IL)-4、IL-5和干扰素γ(interferon-γ,IFN-γ)的ELISA试剂盒购自上海晶美生物制药有限公司；小鼠IgE和IgG试剂盒购自上海亿欣生物科技有限公司；抗小鼠TGF-β1抗体购自R&D；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自广州捷倍斯生物科技有限公司。

2 方法

2.1动物及分组 取雌性BALB/c小鼠40 只， 6～8周龄, 体重(20.0±2.0)g，由齐齐哈尔医学院实验动物中心提供和饲养，随机分为正常对照(normal control)组、哮喘模型(asthma model)组、人参皂苷Rh1小剂量治疗(low-dose treatment)组和人参皂苷Rh1大剂量治疗(hing-dose treatment)组，每组10只。在温度20 ℃～25 ℃, 湿度30%～35%, 自动空气清洁设备的条件下饲养，自由摄食。

2.2哮喘模型的制备以及给药方法 小鼠于实验第1天和第7天分别腹腔注射OVA抗原液0.2 mL，全身致敏2 次。第15天起将小鼠置于自制的封闭玻璃密闭容器内, 将卵清蛋白溶解于 PBS制作1%的溶液，用喷雾器雾化攻击，每天30 min，诱导小鼠气道过敏，连续激发刺激2周。人参皂苷Rh1治疗组于实验第15天起在激发刺激前30 min，分别灌胃人参皂苷Rh1 40 mg/kg和80 mg/kg，每天一次。正常对照组按照上述方法利用相同剂量生理盐水代替进行腹腔注射、激发刺激和灌胃。

2.3标本的处理和EOS的计数 在末次激发攻击24 h后，用3%戊巴比妥钠(1 mL)腹腔注射处死动物, 经心脏穿刺取血液，分离血清后，储存于-80 ℃备用。小鼠处死后，打开胸腔，结扎右侧主支气管，经气管插管，用Hanks液灌洗左肺, 每次5 mL, 共6次, 计30 mL，收集灌洗液，离心制成细胞悬液，获得BALF。混匀收集的BALF，离心后取上清液，分装于试管封闭后在-20 ℃保存；另外，在沉淀里加入红细胞溶解缓冲液200 μL，充分混合在冰块里放置2 min，然后加入800 μL 的RPMI-1640 细胞培养液，4 000 r/min离心3 min，除去上清液，取沉淀再加1 mL RPMI-1640细胞培养液，摇匀后取20 μL做细胞记数，最终取4×104个细胞用Diff-Quik染色，观察EOS的数量。解剖小鼠迅速取右肺下小叶，放入液氮速冻，用于Western blot测定；取出左肺下叶用4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋切片，HE染色后，经显微镜观察肺组织的病理学变化。

2.4免疫球蛋白的测定 于96孔细胞培养板每孔加入卵清蛋白(5 mL/L，PBS缓冲液配制) 4 ℃ 过夜，用PBS缓冲液冲洗，然后加入1% BSA(PBS缓冲液配制)，每孔150 μL，在37 ℃ 培养1 h，用PBS缓冲液冲洗。把已经取好的血清用缓冲液稀释后，每孔加入200 μL在 37 ℃ 培养3 h，用PBS缓冲液冲洗。将IgE和IgG抗体用缓冲液稀释后，每孔加入100 μL 37 ℃ 培养2 h，再用PBS缓冲液冲洗，最后取底物用碳酸盐缓冲液(pH 9.6)配成1 g/L，每孔加入100 μL，分别培养15 min(IgG)和12 h(IgE)，于波长405 nm和492 nm下用分光光度计测定吸光度(A)。

2.5细胞炎症因子的测定 采用ELISA法，参照试剂盒说明书，分别检测BALF中IL-4、IL-5和IFN-γ 表达水平的变化。

2.6Western blot检测 取液氮保存的肺组织解冻，制备匀浆离心，取上清按照蛋白浓度检测试剂盒的说明操作。将已获得的各组蛋白质按照常规操作方法进行电泳、转膜，并加入抗TGF-β1抗体反应24 h，用ECL显色。利用图像分析系统扫描，用β-actin作为内参照。

3 统计学处理

用GraphPad Prism 5.0统计软件进行分析。数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较采用SNK法进行检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 人参皂苷Rh1对BALF中嗜酸性粒细胞数量的影响

BALF中嗜酸性粒细胞的计数结果发现，与正常对照组比较，哮喘模型组嗜酸性粒细胞数量明显增多，差异有统计学意义(P<0.01)；与哮喘模型组比较，人参皂苷Rh1大剂量组和小剂量组嗜酸性粒细胞均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与人参皂苷Rh1小剂量组比较，人参皂苷Rh1大剂量组嗜酸性粒细胞数量明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

2 人参皂苷Rh1对血清中免疫球蛋白IgE和IgG变化的影响

与正常组比较，哮喘模型组血清中的IgE和IgG明显增多，差异有统计学意义(P<0.01)；与哮喘模型组比较，人参皂苷Rh1治疗组血清中的IgE 明显减少，差异有统计学意义(P<0.01)，但是血清IgG的差异无统计学显著性(P>0.05)；与人参皂苷Rh1小剂量组比较，大剂量组中IgG水平降低(P<0.05)，见表1。

3 人参皂苷Rh1对BALF中 IL-4、IL-5和IFN-γ水平的影响

BALF中的 IL-4、IL-5和IFN-γ有特征性变化。与正常对照组比较，哮喘模型组BALF中IL-4、IL-5和IFN-γ明显增多，差异有统计学意义(P<0.01)； 与哮喘模型组比较，人参皂苷Rh1大剂量组、小剂量组IL-4、IL-5和IFN-γ 减少，差异有统计学意义(P<0.01)；与人参皂苷Rh1小剂量组比较，大剂量组中仅IFN-γ水平降低，差异有统计学显著性(P<0.05)，见表2。

表1人参皂苷Rh1对BALF中嗜酸性粒细胞计数以及血清中IgE和IgG水平的影响

Table 1. The effects of ginsenoside Rh1 on the number of eosinophils in BALF and the serum concentrations of IgE and IgG (Mean±SD.n=10)

GroupEosinophils(×109/L)IgE(μg/L)IgG(μg/L)Normalcontrol13.16±2.141.000±0.0231.000±0.207Asthmamodel166.33±29.16##1.365±0.031##7.114±0.888##Low-dosetreatment82.43±12.04##$1.203±0.024$6.042±1.012High-dosetreatment26.26±4.29##$$&&1.144±0.023$$5.894±0.912&

##P<0.01vsnormal control group;$P<0.05,$$P<0.01vsasthma model group;&P<0.05，&&P<0.01vslow-dose treatment group.

表2 人参皂苷Rh1对BALF中IL-4、 IL-5和IFN-γ水平的变化

##P<0.01vsnormal control group;$P<0.05,$$P<0.01vsasthma model group;&P<0.05vslow-dose treatment group.

4 各组小鼠肺组织病理学的变化

各组小鼠肺组织经HE染色后，光学显微镜观察结果如下：正常对照组小鼠肺组织细支气管和肺泡壁结构完整、界限清楚，无炎症细胞浸润；哮喘模型组小鼠肺内细支气管上皮损伤缺失，上皮细胞增厚，在支气管及其周围充血，有大量的嗜酸粒细胞、中性粒细胞和巨噬细胞等炎症细胞浸润，导致支气管管腔狭窄；人参皂苷Rh1大、小剂量组肺组织支气管及其周围组织炎症细胞明显减少，肺组织纹理清晰，显著改善肺组织病理变化，见图1。

Figure 1. Pathological changes of mouse lung tissues (HE staining, × 200). A: normal control group; B: asthma model group; C: low-dose treatment group; D: high-dose treatment group.

图1各组小鼠肺组织病理学变化

5 肺组织中TGF-β1蛋白表达的变化

与正常对照组比较，模型组TGF-β1蛋白的表达明显增高，差异有统计学意义(P<0.01)；人参皂苷Rh1小剂量组和大剂量组的TGF-β1蛋白的表达明显减少，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)；与小剂量组比较，人参皂苷Rh1大剂量组的TGF-β1蛋白表达减少(P<0.05)，见图2。

Figure 2. The protein expression of TGF-β1 in mouse lung tissures. Mean±SD.n=10.#P<0.05,##P<0.01vsnormal control group;$$P<0.01vsasthma model group;&P<0.05vslow-dose treatment group.

图2各组肺组织中TGF-β1蛋白的表达

讨 论

支气管哮喘是以气道内各种炎症细胞的弥漫性浸润为主要病变的气道炎症性疾病，其发病过程复杂，与不同类型的细胞因子、炎症介质以及它们之间相互作用密切相关。近年来，随着对支气管哮喘研究的深入，从不同角度的研究结果表明，免疫学功能变化为其主要机制。多年的研究结果认为，哮喘的发病机制与Th1/Th2细胞的异常分化以及调控比例失衡有关。Th1/Th2功能失衡是哮喘发病的主要原因[4-5]。各类T细胞分泌各种细胞因子，对体内的免疫功能起协调作用。Th1细胞分泌 IFN-γ、IL-2和 TNF-β1等，主要参与机体内炎症反应、过敏和细胞免疫过程。尤其IFN-γ 是Thl 细胞分泌的重要细胞因子，可控制Th2 细胞的转化，保持Thl /Th2的相对平衡。Th2细胞主要刺激B细胞增殖活化产生抗体，主要介导体液免疫反应[6-7]，并分泌IL-4和IL-5等细胞因子，诱发哮喘的气道炎症反应，其中起关键作用的IL-4能促进 B细胞分化、增殖和活化，诱导B细胞产生特异性 IgE，参与哮喘的发生和发展。此外，IL-4和IL-5促进EOS在哮喘气道中的聚集和弥漫性浸入，同时抑制EOS的凋亡，加重气道内的炎症过程。因此，利用中医药治疗支气管哮喘在不同的角度深入，对支气管哮喘发病机制的各个方面进行了气道慢性炎症的发病原因、体内免疫调控机制等环节的分析[8]。人参具有滋补元气，强壮机体，安神益智，调节代谢，提高免疫等多种药效。因此，对稳定全身各系统的相互作用有重要的保护作用。本实验利用卵蛋白诱导小鼠哮喘模型，通过检测小鼠血清中免疫球蛋白IgE和IgG的变化，以及BALF中的IL-4、IL-5和IFN-γ的变化，证实了人参皂苷Rh1对哮喘的治疗作用，并解释了哮喘的发病机制。从表2中可知，IL-4和IL-5为主的Th2细胞因子的增多是Th2细胞优势反应，这是哮喘的主要发病机制之一。但在实验中发现哮喘小鼠的BALF中Th1细胞分泌的IFN-γ水平明显增多。多数学者认为提高Th1细胞因子会缓解哮喘作用，但也有完全相反的报道。在哮喘发病过程中Th2细胞因子的机制相对较明确，而Th1相关的细胞因子的作用需要进一步探讨。多数学者认为，Th1相关的细胞因子为靶点是哮喘治疗的有效方法之一。因此，本实验结果说明人参皂苷Rh1能明显抑制IL-4和IL-5等Th2 细胞因子，同时抑制IFN-γ为主的Thl 细胞因子，改变Th1/Th2细胞的平衡，抑制Th2细胞的优势反应一定程度上逆转Th1/Th2功能失衡，达到缓解哮喘的作用。本研究结果可知，哮喘模型组IL-4、IL-5和IgE的表达显著高于正常组，说明哮喘小鼠Th2 细胞介导的免疫反应亢进。人参皂苷Rh1治疗组的 IL-4、IL-5和IgE 显著低于哮喘模型组，证明通过降低IL-4和IL-5的合成，抑制IgE 的表达，能减轻哮喘的炎症反应。

支气管哮喘的气道病理变化与多种炎症细胞有关。如EOS、T淋巴细胞、肥大细胞和中性粒细胞等。EOS在哮喘的发病中起很重要的作用,已知BALF和血中EOS数量增加。EOS参与支气管哮喘的气道的损伤过程，还能合成和释放白三烯、血小板活化因子等多种炎症介质, 诱发免疫系统加重哮喘的症状[10]。 本实验发现，小鼠诱发模型后气道灌洗液中EOS明显增多，是引起哮喘的主要原因，经人参皂苷Rh1治疗后，气道灌洗液中的EOS随之减低[8-9]。 研究表明,哮喘患者BALF中存在大量活化的Th2 细胞, 并且其IL-4和IL-5的mRNA 表达水平升高, 程度与肺组织炎症细胞浸润呈显著正比, 因此从哮喘发病机制的角度来看，调节Th1和Th2细胞的分化以及细胞因子的相对平衡是治疗哮喘最有效的途径[11-13]。本研究中，哮喘小鼠BALF 中IL-4、IL-5和IFN-γ明显增高，与正常对照组相比炎症细胞总数和EOS 均增高。目前应用于哮喘治疗的药物很多，其中比较常见的糖皮质激素以抑制炎症为主, 能抑制哮喘气道各种细胞因子的表达。虽然有较好的疗效, 但并不能从根本上解决疾病的发病和进展, 副作用明显，也不能完全调控Th1/Th2 功能失衡[14]。本研究认为，人参皂苷Rh1能有效控制哮喘发病过程中的炎性因子的表达，是一个良好的抗过敏的中药，应用于过敏性疾病的治疗。

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