线粒体DNA变异与肿瘤的相关性研究进展

综述 审校

肿瘤的发生发展是由多基因、多信号通路参与的复杂生物学过程。近10余年的研究表明，针对一种代谢特征的研究不适用于所有的肿瘤类型，对肿瘤发生发展的研究及对临床治疗的探索正在突破越来越多的传统模式。在线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）产生变异时，肿瘤细胞会发生迁移，最终导致转移灶的形成。而线粒体作为细胞的“能量工厂”，在这一过程中充当了促使肿瘤转移的“开关”。并且，mtDNA变异是涉及肿瘤疾病发展及预后等方面的重要因素，其在肿瘤发生发展中的作用正备受关注。因此，进一步深入理解mtDNA变异的发生规律及作用机制，为肿瘤疾病的诊断、治疗及预后判断提供有意义的参考是极有必要的。

1 肿瘤细胞中mtDNA的变异

mtDNA是高等动物细胞内唯一的核外DNA，在调节线粒体功能方面起着至关重要的作用，其变异主要包括点突变、缺失、插入及拷贝数的改变，而近年一些研究也发现mtDNA和nDNA的比率与恶性肿瘤的发生及进展密切相关。

1.1 点突变

点突变是肿瘤细胞中最常见的mtDNA变异，线粒体 DNA 控制区（displacement loop，D-loop）是mtDNA转录复制的调控区，同时也是mtDNA突变的热点区域，其中包含一个多聚胞嘧啶区（np303-np315），命名为D310，是恶性肿瘤mtDNA最常见的突变区。Shakhssalim等[1]在110个变异中发现了48个新突变，膀胱癌患者显著存在C16069T变异；在D310中，包括C7TC6、C8TC6、C9TC6和C10TC6，这些变异在膀胱癌的病因中发挥重要作用，促进了对致癌突变的定义。De等[2]在核苷酸57处的mtDNA起始复制位点和D300-310区段中也证实了另外两个点突变A4767G和G13481A。Ye等[3]评估来自乳腺癌患者的肿瘤、相邻非肿瘤和良性乳腺疾病（benign breast disease，BBD）患者的组织样本，发现D环区域的核苷酸16 106和16 437之间的MnⅡ位点突变可能影响乳腺癌的发生。Guo等[4]通过对40例人喉鳞状细胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）患者的癌旁组织和外周静脉血样中的mtDNA检测发现，有21例（52.5%）具有体细胞mtDNA D环突变，而在34个突变点中，28个（82.4%）位于HVⅡ，6个（17.6%）位于HVⅠ。Pereira等[5]认为肿瘤中体细胞mtDNA突变的致病性较非肿瘤组织显著增高，且与氨基酸变异集合中的随机选择是无法分开的。Har⁃die等[6]在胰腺癌细胞系（patient derived cell lines，PD⁃CL's）中鉴定了24个mtDNA体细胞突变，在与线粒体代谢功能密切相关的1 000个nDNA中鉴定出另外18个突变，结果表明胰腺肿瘤的异质基因组可能会有共同的代谢表型，但不同肿瘤是通过不同的遗传机制完成合成代谢需求。

1.2 缺失及插入

目前，在肿瘤细胞中已发现超过一百种mtDNA片段缺失，其中mtDNA 4 977 bp（np8 470-np13 447）大片段缺失是最为常见的一种。Tao等[7]对中国温州地区104例结直肠癌（colorectal cancer，CRC）患者的临床特征和mtDNA进行了全面分析，表明在CRC的早期阶段可能出现大量4 977 bp片段缺失，且随着肿瘤TNM分期增高缺失数量降低。Nar等[8]研究表明当哇巴因与2-脱氧葡萄糖（2-deoxyglucose，2-DG）联合时，mtDNA损伤和mtDNA4977缺失频率增加，哇巴因可以通过在癌细胞中引起氧化应激来诱导DNA损伤和细胞凋亡。Han等[9]证实了mtDNA片段的缺失可以抑制肺癌细胞的生物合成和代谢，而C-myc可能作为缺氧和放射条件下的关键基因，在诱导肺癌细胞凋亡中起到重要作用。Datta等[10]研究发现，在健康组和白细胞组的mtDNA缺失分别比癌组织低9.8倍和10.5倍，已发现的mtDNA插入呈现不明显特异性。Ye等[11]评估了来自55例原发性乳腺癌患者和21例BBD患者的肿瘤组织和邻近组织，发现在所有样本中检测到mtDNA4977插入突变，其水平为0.000 149%～7.0%，虽然目前研究提示这些插入不具有肿瘤特异性，但其可能会作为衡量肿瘤变异度的相关因素。

1.3 拷贝数变异

mtDNA功能的发挥既依赖于其分子结构的完整性，同时也与细胞中mtDNA拷贝数密切相关。Castle等[12]使用500万33 nt的读数检测到人肺良性肿瘤细胞（UMC-11）的大量拷贝数变异。Mengelfrom等[13]在对1 067例年龄为18～93岁丹麦患者研究中发现血液中的mtDNA通过拷贝增加更多的mtDNA组群，与老年人的健康水平及生存质量密切相关。Cui等[14]研究中发现，在CRC组织中的mtDNA拷贝数与相应的非肿瘤组织相比较低，较低mtDNA拷贝数的患者比较高mtDNA拷贝数的患者3年生存率低，与淋巴结转移显著相关，证实了mtDNA拷贝数的高低与CRC的恶性程度显著相关。并且，mtDNA拷贝数的改变在不同类型肿瘤中有着显著性差异[1-4，14-28]：脑癌、食管癌、喉癌、子宫内膜癌、甲状腺乳头状癌及神经胶质瘤组织中mtDNA拷贝数明显增加，而肝癌、胃癌、口腔癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌及尤氏肉瘤组织中mtDNA拷贝数显著降低。Luna等[15]发现mtDNA3196G、9952A、10006G、10398G的突变，mtD⁃NA氧化损伤和mtDNA拷贝数增高的组合效应使女性儿童脑肿瘤发病率超出儿科脑肿瘤正常发病率的51倍，其结果对儿童脑肿瘤的治疗具有指导意义。研究证实氧化磷酸化产能或者呼吸功能的下降可能有助于肿瘤细胞增殖及侵袭能力的增强，而mtDNA作为对其的一种适应性反应则表现出拷贝数量的增加，在一定程度上导致突变进行性累积，为肿瘤细胞的恶性变异、转移蓄积了内在动力。因此，通过选择性地诱导mtDNA损伤，调控mtDNA的拷贝数量将有助于肿瘤的靶向治疗。

1.4mtDNA/nDNA

mtDNA诱发细胞癌变的另一个可能途径是通过mtDNA分子及片段在nDNA中整合来实现的，并使mtDNA与nDNA的比值产生变化。Evdokimovsky等[16]观察到放疗辐射后的小鼠，其有核血细胞中的氧化磷酸化相关基因cytb、ATP6、ND4、ND2和D环区域的转录，血液细胞中mtDNA/nDNA的比例减少50%，血清中mtDNA/nDNA比值增加，这种释放进入血液循环的机制，被认为是由于肿瘤的增生或转移引起的细胞凋亡、组织坏死、炎症和线粒体功能障碍所导致的。Chiba等[17]对mtDNA单层（2D）和三维（3D）培养的CRC细胞进行比较，与2D细胞相比，在3D细胞中观察到mtDNA水平显著降低，且在3D球状细胞培养物中观察到的mtDNA/nDNA比值降低。表明与缺氧条件相比，CRC细胞在含氧量正常条件下，其胞质中所含的大量线粒体会使细胞增殖分化失控，诱发癌变。Zhang等[18]在放疗辐射6个月后的BALB/c小鼠肝脏中观察到mtDNA/nDNA比例升高，而肌肉、非再生器官表现出mtDNA的减少，肝脏中较高的mtDNA含量是该器官适应高氧化应激的结果，提示在接受放疗的肿瘤患者中，mtDNA/nDNA可能作为今后重要的临床诊断依据。Mohammed等[19]在6例CRC组织和3例健康对照中发现，线粒体基因tRNALeu（CUN）中的多态性突变A12308G可能是mtDNA与nDNA结合产生癌症的致病突变，可能用作未来的诊断工具之一。因此，mtDNA除了自身的变化可使其成为一种潜在的致癌靶标，还能通过与nDNA的相互作用激发细胞的癌变潜能。

2 mtDNA变异与肿瘤的发生

Zhang等[20]发现在胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）患者中mtDNA含量比健康对照组显著升高。Bao等[21]发现mtDNA在老年肝癌（hepato⁃cellular carcinoma，HCC）患者的病因中起着关键作用。Platek等[22]发现mtDNA突变在乳腺癌中尤其是雌激素受体（estrogen receptor，ER）阴性的乳腺癌患者中更为频繁，证实了其可以参与诱导乳腺癌发生。Feng等[23]研究表明mtDNA突变可能影响人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染和宫颈癌的发生。Chen等[24]研究表明C-myc基因可能通过参与mtDNA的序列整合到子宫颈上皮细胞核中，并参与子宫颈上皮细胞癌的发生。Chattopadhyay等[25]在口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）组织中发现，mtDNA突变和拷贝数在癌症组织中呈低表达，推测氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）复合蛋白的功能损伤可能有利于癌细胞生长。Liu等[26]将OSCC患者非癌组织中mtDNA序列与癌组织的D环进行比较，发现大量体细胞突变。Zhang等[27]进一步通过克隆和测序mtDNA D环区域，发现D环中的体细胞突变在癌组织中显著增多，并且Datta等[10]也证实D环中的体细胞突变可促进癌症发生。Lee等[28]基于CRC中端粒和线粒体的频繁遗传变化，从109例CRC组织、64例结肠直肠管腺瘤和28例锯齿状息肉中提取mtDNA，其PCR结果表明，端粒和线粒体之间的调节功能丧失可能触发癌症因子，促使CRC的发生。因此，对mtDNA突变的检测可能会成为癌症早期筛查的重要参考指标。

3 mtDNA变异与肿瘤发展及预后

Zhang等[29]认为低mtDNA拷贝数可能提示了晚期胃癌患者的不良预后，可变mtDNA含量增加了淋巴结转移的风险和晚期患者的死亡率。Bao等[21]认为在HCC患者中，较长的白细胞相对端粒长度以及较低的mtDNA拷贝数预示较差的预后。Dang等[30]认为低mtDNA含量与一些临床病理特征如吸烟、TNM分期密切相关，可能导致喉癌患者的不良预后，与肿瘤患者生存率具有一定的相关性。Feng等[23]认为高mtDNA含量加上10398A突变可能是宫颈癌预后不良的标志物。Yeung等[31]在GBM细胞系的编码和非编码区域内鉴定了大量的mtDNA变体，频率在D环最大，且p53突变显著增加，蛋白质基因ND6是最易发生的突变基因，而蛋白质基因ND4具有最高的突变频率，新型变体通过提供电子传递链（electron transfer chain，ETC）来促进GBM的发展，促进厌氧糖酵解的发生，导致肿瘤细胞增殖的加速。Chen[32]指出上皮癌细胞和癌相关基质中线粒体功能的调节异常可促进转移灶的形成，mtDNA D环的体细胞突变与癌症患者的生存率相关，这种突变负荷的增加提示正常细胞向癌细胞转化。总之，mtDNA已经作为新型的肿瘤标志物对不同肿瘤发展的各个时期及患者预后情况的判定起到重要作用。

4 mtDNA变异与肿瘤临床治疗

Ye等[33]通过PCR技术准确定量在血浆提取循环细胞mtDNA，第三代PCR检测（droplet digital PCR，ddPCR）被证明比实时荧光定量检测（quantitative PCR，qPCR）技术更简单和灵敏，而没有提取的血浆可以直接用于ddPCR中检测外源核酸。D-loop是影响活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生mtDNA改变的热点，锰超氧化物歧化酶（mitochondrial super⁃oxide dismutase，Mn-SOD）是保护细胞免受ROS介导损伤的抗氧化酶。Govatati等[34]通过分析线粒体D环和Mn-SOD表达的CRC序列改变之间的关系，证实线粒体微卫星不稳定性（mitochondrial microsatellite instability，mtMSI）和Mn-SOD过度表达的检测，可能有助于识别高风险的患者。Safdar等[35]报道聚合酶-γ射线（polymerase-gamma1，POLG1）被认为是目前唯一的mtDNA修复酶，证明p53在运动介导的维护mtDNA中的作用，并证实了线粒体靶向p53作为线粒体病因疾病的新型治疗方式。Ishikawa等[36]认为高转移特性的肿瘤细胞mtDNA中ND6基因的G13997A突变导致了ROS的过量产生，为肿瘤转移提供条件，这意味着抗氧化剂的使用可以有效抑制肿瘤转移的发生。Yeung等[37]研究表明博来霉素可以作为诱导急性髓细胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）细胞mtDNA损伤的药物，且在原代AML中发挥同样作用，采用mtDNA靶向治疗可能是AML的有效方法。mtDNA变异的相关研究将不断应用于临床，为生物医学的进步提供更广阔的空间。

5 结语

线粒体作为为生命体提供能量的场所，是肿瘤细胞代谢环节的关键点。目前，对mtDNA变异是否是肿瘤发生的诱因尚不明确，mtDNA在肿瘤治疗中的作用研究也存在着样本量小、研究方法不统一、对不同肿瘤类型及肿瘤发生发展各个阶段的针对性不明确等弊端。因此，未来更需要注意的是，针对mtD⁃NA变异的靶向治疗研究不能拘泥于某单一位点，而是要结合其单倍体类型，规避表观遗传改变，使其在临床治疗中适用于肿瘤发生发展等不同阶段的代谢变化。

综上所述，由于肿瘤生物学的高度复杂性，临床上更迫切的需要新的治疗方法，而掌握肿瘤细胞发生发展过程中所涉及的线粒体代谢的参与过程及机制可以为临床综合治疗提供新的思路。相信随着科学研究的深入，mtDNA变异与肿瘤等各类疾病的相关性会被更进一步地揭示，以线粒体为靶向的肿瘤治疗方案也将广泛应用于临床。

[1]Shakhssalim N,Houshmand M,Kamalidehghan B,et al.The mito‐chondrial C16069T polymorphism,not mitochondrial D310(D‐loop)mononucleotidesequencevariations,isassociatedwithbladdercancer[J].Cancer Cell Int,2013,13(1):120.

[2]De VH,Mendonça BS,Elseth KM,et al.Part II.Mitochondrial muta‐tional status of high nitric oxide adapted cell line BT‐20(BT‐20‐HNO)as it relates to human primary breast tumors[J].Tumor Biol,2013,34(1):337‐347.

[3]Ye C,Shu XO,Pierce L,et al.Mutations in the mitochondrial DNA D‐loop region and breast cancer risk[J].Breast Cancer Res Treat,2010,119(2):431‐436.

[4]Guo W,Yang D,Xu H,et al.Mutations in the D‐loop region and in‐creased copy number of mitochondrial DNA in human laryngeal squamous cell carcinoma[J].Mole Biol Rep,2013,40(1):13‐20.

[5]Pereira L,Soares P,Máximo V,et al.Somatic mitochondrial DNA mutations in cancer escape purifying selection and high pathoge‐nicity mutations lead to the oncocytic phenotype:pathogenicity analysis of reported somatic mtDNA mutations in tumors[J].Bmc Cancer,2012,12(1):1‐10

[6]Hardie RA,Dam EV,Cowley M,et al.Mitochondrial mutations and metabolic adaptation in pancreatic cancer[J].Cancer Metab,2017,5(1):2.

[7]Tao C,Jing H,Shen L,et al.The mitochondrial DNA 4,977‐bp dele‐tion and its implication in copy number alteration in colorectal can‐cer[J].BMC Medi Gene,2011,12(1):8.

[8]Nar R,Bedir A,Alacam H,et al.The effect of ouabain on mitochon‐drial DNA damage in HepG2 cell lines[J].Tumor Biol,2012,33(6):2107‐2115.

[9]Han CB,Sun L,Ma JT,et al.The influence of mtDNA deletion on lung cancer cells under the conditions of hypoxia and irradiation[J].Lung,2014,192(6):997‐1004.

[10]Datta S,Chattopadhyay E,Ray JG,et al.D‐loop somatic mutations and 5 kb"common"deletion in mitochondrial DNA:important mo‐lecular markers to distinguish oral precancer and cancer[J].Tumor Biol,2015,36(4):3025‐3033.

[11]Ye C,Shu XO,Wen W,et al.Quantitative analysis of mitochondrial DNA 4977‐bp deletion in sporadic breast cancer and benign breast diseases[J].Breast Cancer Res Treat,2008,108(3):427‐434.

[12]Castle JC,Biery M,Bouzek H,et al.DNA copy number,including telomeres and mitochondria,assayed using next‐generation se‐quencing[J].BMC Genomics,2010,11(1):1‐11.

[13]Mengelfrom J,Thinggaard M,Kyvik KO,et al.Mitochondrial DNA copy number in peripheral blood cells declines with age and is as‐sociated with general health among elderly[J].Human Gene,2014,133(9):1149‐1159.

[14]Cui HH,Huang P,Wang ZJ,et al.Association of decreased mito‐chondrial DNA content with the progression of colorectal cancer[J].BMC Cancer,2013,13(1):110.

[15]Luna B,Bhatia S,Yoo C,et al.Proteomic and mitochondrial genom‐ic analyses of pediatric brain tumors[J].Mole Neurobiol,2015,52(3):1341‐1363.

[16]Evdokimovsky EV,Ushakova TE,Kudriavtcev AA,et al.Alteration of mtDNA copy number,mitochondrial gene expression and extracel‐lular DNA content in mice after irradiation at lethal dose[J].Radi Environ Biophy,2011,50(1):181.

[17]Chiba M,Yokoyama C,Okada M,et al.Mitochondrial DNA reduced by hypoxic conditions in three‐dimensional(3D)spheroid cell cul‐tures[J].Tumor Biol,2014,35(12):12689‐12693.

[18]Zhang SB,Zhang M,Cao Y,et al.Delayed dffects of radiation on mi‐tochondrial DNA in radiation‐sensitive organs[M].Oxygen Trans‐port to Tissue XXXIII.Springer New York,2012:139‐145.

[19]Mohammed FM,Khorasany ARR,Mosaieby E,et al.Mitochondrial A12308G alteration in tRNA Leu(CUN)in colorectal cancer samples[J].Diagno Path,2015,10(1):1‐4.

[20]Zhang J,Li D,Qu F,et al.Association of leukocyte mitochondrial DNA content with glioma risk:evidence from a Chinese case‐con‐trol study[J].BMC Cancer,2014,14(1):680.

[21]Bao D,Ba Y,Zhou F,et al.Alterations of telomere length and mtD‐NA copy number are associated with overall survival in hepatocel‐lular carcinoma patients treated with transarterial chemoemboliza‐tion[J].Cancer Chemother Pharmacol,2016,78(4):1‐9.

[22]Platek ME,Shields PG,Tan D,et al.Alcohol consumption and breast tumor mitochondrial DNA mutations[J].Breast Cancer Res Treat,2010,121(2):453‐460.

[23]Feng D,Xu H,Li X,et al.An association analysis between mitochon‐drial DNA content,G10398A polymorphism,HPV infection,and the prognosis of cervical cancer in the Chinese han population[J].Tu‐mor Biol,2016,37(4):1‐9.

[24]Chen D,Xue W,Xiang J.The intra‐nucleus integration of mitochon‐drial DNA(mtDNA)in cervical mucosa cells and its relation with c‐myc expression[J].J Exp Clin Cancer Res,2008,27(1):36.

[25]Chattopadhyay E,De SN,Singh R,et al.Genome‐wide mitochondri‐al DNA sequence variations and lower expression of OXPHOS genes predict mitochondrial dysfunction in oral cancer tissue[J].Tu‐mor Biol,2016,37(9):11861‐11871.

[26]Liu SA,Jiang RS,Chen FJ,et al.Somatic mutations in the D‐loop of mitochondrial DNA in oral squamous cell carcinoma[J].Eur Arch Otorhinolaryngol,2012,269(6):1665‐1670.

[27]Zhang Y,Wang B,Liang Q,et al.Mitochondrial DNA D‐loop AG/TC transition mutation in cortical neurons of mice after long‐term ex‐posure to nucleoside analogues[J].J Neurovir,2015,21(5):500.

[28]Lee H,Cho JH,Park WJ,et al.Loss of the association between telo‐mere length and mitochondrial DNA copy number contribute to colorectal carcinogenesis[J].Path Oncol Res,2018,24(2):323‐328.

[29]Zhang G,Qu Y,Dang S,et al.Variable copy number of mitochondri‐al DNA(mtDNA)predicts worse prognosis in advanced gastric can‐cer patients[J].Diag Path,2013,8(1):173.

[30]Dang S,Qu Y,Jing W,et al.Low copy number of mitochondrial DNA(mtDNA)predicts worse prognosis in early‐stage laryngeal cancer patients[J].Diag Path,2014,9(1):28.

[31]Yeung KY,Dickinson A,Donoghue JF,et al.The identification of mi‐tochondrial DNA variants in glioblastoma multiforme[J].Acta Neu‐ropath Commun,2014,2(1):1.

[32]Chen EI.Mitochondrial dysfunction and cancer metastasis[J].J Bio‐energe Biomem,2012,44(6):619‐622.

[33]Ye W,Tang X,Liu C,et al.Accurate quantitation of circulating cell‐free mitochondrial DNA in plasma by droplet digital PCR[J].Analyt Bioanalyt Chemis,2017,409(10):2727‐2735.

[34]Govatati S,Malempati S,Saradamma B,et al.Manganese‐superox‐ide dismutase(Mn‐SOD)overexpression is a common event in colorectal cancers with mitochondrial microsatellite instability[J].Tumor Biol,2016,37(8):10357‐10364.

[35]Safdar A,Khrapko K,Flynn JM,et al.Exercise‐induced mitochondri‐al p53 repairs mtDNA mutations in mutator mice[J].Skeletal Mus‐cle,2016,6(1):1‐18.

[36]Ishikawa K,Imanishi H,Takenaga K,et al.Regulation of metastasis;mitochondrial DNA mutations have appeared on stage[J].J Bioen‐erge Biomem,2012,44(6):639‐644.

[37]Yeung M,Hurren R,Nemr C,et al.Mitochondrial DNA damage by bleomycin induces AML cell death[J].Apoptosis,2015,20(6):811‐820.