胰腺癌微环境治疗策略的进展与思考

目前大多数研究重点为胰腺癌细胞本身在肿瘤发生发展中的作用及分子机制，且临床应用的药物也大多靶向肿瘤细胞，但由于胰腺癌细胞异质性强，直接杀伤肿瘤细胞治疗策略的疗效存在较大的个体化差异，且常有耐药性的发生。众所周知，肿瘤微环境是肿瘤细胞发生、发展和转移等赖以生存的基础，异质性较小，目前关于肿瘤微环境及其与肿瘤间密切关系的研究也越来越多，因此靶向肿瘤微环境可有效阻断肿瘤细胞与微环境之间的相互作用，具有高效、广谱等特点[1]。与其他恶性肿瘤相比，胰腺癌的间质异常丰富，组织病理学特征呈明显的“间质化”，即局部浸润的肿瘤组织周围发生显著的间质增生反应。这些间质成分包括胰腺星形细胞（pancreat⁃ic stellate cells，PSCs）、免疫细胞、血管和淋巴内皮细胞以及丰富的细胞外基质等，且纤维化的程度与胰腺癌患者预后呈正相关[2]。有研究发现，慢性炎症与肿瘤之间的关系密切相关[3-4]，这些富含炎症细胞的微环境在慢性胰腺炎向胰腺癌缓慢进展过程中发挥决定性的作用。因此，靶向调节胰腺癌微环境，是抗胰腺癌精准治疗的有效策略。本文就近年来胰腺癌微环境中涉及的基质细胞在肿瘤发生发展中的作用及靶向基质细胞治疗研究进展予以综述。

1 胰腺癌肿瘤微环境特点

肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME），更像是一种生态环境，新生的肿瘤细胞、间质细胞、细胞基质、生长调节因子以及其他细胞成分相互作用形成一个复杂的混合体，促进肿瘤细胞的增殖和迁移。胰腺癌的微环境对胰腺癌的生物学行为有重要而复杂的影响，在肿瘤发生发展过程中，形成一个有利于肿瘤细胞生存、增殖、远处转移的微环境，并能降低对肿瘤细胞的杀伤治疗效果和逃避免疫监视[5]。近年来，许多研究证实靶向重塑肿瘤微环境有较好的抗肿瘤效果，提示TME重塑治疗策略的可能性。本文主要围绕胰腺癌微环境中存在的PSCs相关治疗策略和靶向间质纤维化的临床研究结果，免疫抑制细胞，如肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）、髓源性抑制细胞（myeloid de⁃rived suppressor cells，MDSC）和调节性T细胞（T regu⁃latory cells，Treg）细胞，以及针对不同细胞的治疗策略和免疫检查点抑制剂在胰腺癌中的一些临床研究予以综述。

1.1 胰腺癌间质中PSCs促肿瘤功能以及靶向PSCs的策略

胰腺中的PSCs存在静止和活化两种不同状态，正常胰腺组织中大多为静止状态下的PSCs，其细胞质中富含维生素A脂滴，可能参与储存脂肪和维生素A、分泌少量细胞因子、趋化因子和细胞因子等生理功能[6]。然而当静止的PSCs被TME内细胞因子等激活后，活化的PSCs胞质中储存的维生素A显著减少、脂滴大量丢失，获得肌成纤维细胞样表型，高表达α-平滑肌肌动蛋白标记物（alpha smooth muscle actin，α-SMA），使得细胞增殖能力明显[7]。

许多研究也证实活化的PSCs可通过旁分泌分泌大量的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）、趋化因子和细胞因子等，同时也可以自分泌的形式来正反馈调节维持其自身的活化状态，这些过程在慢性胰腺炎、慢性纤维化、肿瘤增殖、放疗后再增殖及化疗不敏感中发挥重要作用[8]。

Pang等[9]提出了循环胰腺星状细胞（circulating PSCs，cPSCs）的概念，cPSCs与循环肿瘤细胞（circu⁃lating tumour cells，CTCs）交互影响，为肿瘤细胞发生远处转移提供有利的微环境，揭示了PSCs在胰腺癌转移过程中同样发挥重要作用。综上所述，胰腺肿瘤中活化的PSCs与肿瘤细胞间联系密切，因此精准靶向胰腺癌组织中活化的PSCs，是提高胰腺癌治疗效果的重要方向之一。

有研究试图在小鼠胰腺癌模型中利用基因工程方法将基质中α-SMA阳性成纤维细胞，及癌相关成纤维细胞（carcinoma-associated fibroblasts，CAF）耗尽/敲除，然而最终实验结果却相反，基质细胞完全耗竭后肿瘤变得更具侵袭性[10]。因此，有研究者建议采用其他针对性的方法，如对特定的基质细胞功能进行选择性“重塑”或“再教育”。有研究[11]证实胰腺肿瘤周围活化的PSCs高表达维生素D受体（vitamin D receptor，VDR），研究者通过维生素D衍生物可致活化PSCs失活、基质重塑、抑制胰腺炎组织内的炎症和纤维化，体内与化疗药物联合应用可增加化疗药物肿瘤内的渗入，抑制肿瘤生长，最终显著延长荷瘤小鼠生存时间[11]。Chronopoulos等[12]提示全反式视黄酸（维生素A的活性产物之一）也可以抑制活化PSCs对胰腺癌微环境的重塑应力，从而减少纤维化的产生，进一步抑制肿瘤细胞的侵袭转移。Saison-Ridinger等[13]也报道了在小鼠胰腺癌模型中通过Mdm2拮抗剂Nutlin-3a激活抑癌基因p53，可显著逆转PSCs活化，并降低小鼠胰腺组织内纤维化程度。上述研究结果提示，再重塑基质内星形细胞有望成为胰腺癌治疗的一个辅助策略。

1.2 靶向间质纤维化的研究进展

胰腺癌组织中ECM代谢严重失衡，间质纤维化尤为显著，坚硬的纤维化“外壳”明显限制了化疗药物的有效渗入，是造成胰腺癌化疗药物有效率较低的主要原因，也是胰腺癌预后差的重要因素。白蛋白结合型紫杉醇利用白蛋白独特的转运机制，经血管内皮细胞表面的gp60介导的药物跨膜转运和经肿瘤间质中的富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（SPARC）介导的药物聚集，使其具有明显的药代动力学优势。在人类胰腺癌移植瘤裸鼠研究中发现白蛋白结合型紫杉醇能够显著减少肿瘤间质中纤维成分，增加肿瘤间质内皮细胞成分，可显著提高移植瘤体内吉西他滨的药物浓度[14]。Von等[15]研究数据表明，与吉西他滨单药相比，白蛋白结合型紫杉醇联合吉西他滨在OS、PFS、ORR上均表现出显著的统计学意义，美国国立综合癌症网络（NCCN）诊治指南在2013年最新版中，将白蛋白紫杉醇联合吉西他滨列为转移性胰腺癌一线治疗的标准1类推荐方案。

胰腺癌间质中高表达透明质酸（hyaluronic acid，HA），聚乙二醇化重组人透明质酸酶（PEGPH20）可耗尽肿瘤中的HA，破坏小鼠胰腺组织内血管结构，增加肿瘤的化疗药物灌注[16]。Hingorani等[17]研究显示，与接受白蛋白结合型紫杉醇和吉西他滨（PAG）的高HA患者（HA-High）相比，PEGPH20的加入可显著改善高HA患者无进展生存期（PFS），且两组的ORR分别为34%（AG）和46%（PAG），总生存期（OS）8.5个月vs.11.5个月，TE事件发生率相似。提示PEG⁃PH20+AG或许将成为胰腺癌治疗的一个新标准方案。

2 胰腺癌间质中免疫抑制细胞

胰腺癌微环境中富含不同种类的参与固有免疫和适应性免疫的免疫细胞，其在肿瘤细胞的诱导下处于数量和功能的失衡状态，具有杀伤肿瘤的效应性免疫细胞数量减少、功能丧失。大量免疫抑制细胞的存在使胰腺癌处在免疫抑制的微环境中，有利于胰腺癌细胞逃避免疫监视，从而利于胰腺癌细胞的增殖、侵袭和转移。

2.1 胰腺癌间质中TAMs

TAMs是浸润于TME中最多的免疫细胞，可通过复杂的自分泌与旁分泌途径在促进肿瘤的生长和转移方面发挥重要作用。根据其活化类型及其在TME中的功能，主要分为M1和M2两种类型。其中M1型不仅可以直接介导细胞毒作用发挥抗肿瘤作用，也可分泌大量的促炎因子和黏附分子等，发挥其促进炎症反应和间接抗肿瘤的作用；而M2型TAMs，分泌大量抗炎因子、免疫抑制性配体如程序性死亡受体1的配体（PD-L1），抑制机体免疫反应，通过慢性炎症、基质重塑等促进肿瘤生长和进展[18]。既往本课题组也探讨了M2型TAMs在胰腺癌及配对癌旁组织内的表达及与胰腺癌患者预后的关系，结果显示胰腺癌细胞组织标本中M2型巨噬细胞表达上调，且与胰腺癌患者临床预后呈负相关[19]。

TAMs在不同刺激因子下可实现M1/M2类型转变，为精准靶向重塑TAMs功能、“教育”其从M2类型转变为M1型、抑制胰腺肿瘤生长及转移提供了理论基础。众所周知，巨噬细胞集落刺激因子（colonystimulating factor 1，CSF1）在巨噬细胞的分化、极化和趋化过程中均发挥重要的调节作用。Zhu等[20]报道了在胰腺癌小鼠模型中通过抑制CSF1/CSF1R信号轴活化后可重塑巨噬细胞作用，增强机体抗原递呈作用及效应T细胞抗肿瘤活性。此外，已知CD40也可活化巨噬细胞，使其迅速浸润至肿瘤细胞周围，削弱肿瘤微环境中的免疫抑制作用并能驱使T细胞产生抗肿瘤反应。因此，Beatty等[21]开展了关于CD40激动剂（CP-870，893）联合吉西他滨的一项Ⅰ期临床研究，结果提示（CP-870，893）安全性好，耐受性较好，并能降低PET-CT的FDG摄入改变，具有一定的抗肿瘤活性。美国学者报道了唑来膦酸（zoledronic acid，ZA）在体内外均可杀死小鼠来源的TAMs，从而显著抑制小鼠模型中胰腺癌的生长和转移[22]。有研究[23]分别使用氯膦酸二钠脂质体及其对照脂质体治疗胰腺癌模型鼠12周后，对肿瘤形成、转移以及局部、循环免疫细胞和细胞因子的改变进一步分析，结果表明氯膦酸二钠脂质体治疗组与对照组相比较，可显著降低胰腺原位肿瘤微环境及其他器官（如肝、肺和脾脏）中M2型巨噬细胞的表达量。尽管治疗组对原位胰腺癌的抑制效果并不明显，但其展示了显著的抑制肿瘤远处转移能力，同时抑制肿瘤内血管新生和循环CD4+CD25+T细胞的表达水平。

2.2 胰腺癌间质中的MDSC

MDSC是一类来自骨髓未分化的细胞通过一系列扩增、募集和活化等过程形成的免疫抑制细胞。许多肿瘤患者外周血、肿瘤微环境中均富含MDSC，其通过分泌多种免疫负调节因子，在介导肿瘤免疫逃避、促进肿瘤侵袭转移等过程中发挥重要作用[24]。既往有研究表明，提示MDSC不但可降低肿瘤特异性CD8+T细胞数量，同时还抑制CD8+细胞的活化及杀伤肿瘤的细胞功能[25]。也有研究表明MDSC细胞可通过膜型TGF-β1抑制NK细胞活化受体NKG2D的表达和IFN-R的产生，从而抑制NK细胞的杀伤活性，促进肿瘤生长，研究也发现当减少MDSC细胞时，NK细胞的抗肿瘤活性可逐步得到恢复，而减少Treg细胞却不能恢复[26]。综上所述，MDSC具有同时抑制适应性免疫及固有免疫应答的作用。因此，靶向重塑MDSC可以一定程度上改善肿瘤患者机体内的抗肿瘤免疫应答能力，提示靶向MDSC的肿瘤免疫治疗策略是未来发展的方向之一。

上述研究提示唑来膦酸ZA可以抑制M2型TAMs，从而抑制胰腺癌的生长和转移，近年来也有体内试验证实ZA同时具有抑制MDSC募集和诱导分化的功能，从而改善机体抗肿瘤活性[27]。一项关于ZA治疗胰腺癌的Ⅰ期临床试验报道，结果显示作为新辅助治疗和术后辅助治疗ZA安全性、耐受性良好，但比较ZA治疗前后分析入组患者外周血与骨髓内的MDSC含量差异无统计学意义[28]。近来体外实验表明，阻断粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulo⁃cyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）和吉西他滨化疗药物联合应用，可抑制胰腺癌MDSC的分化和功能，从而改善了胰腺癌杀伤性T淋巴细胞的功能[29]。因此，推测单用靶向免疫细胞的效果有限，需与传统化疗相结合，取长补短，可能会取得较好的抗肿瘤效果。

2.3 胰腺癌间质中的Treg细胞

Treg细胞能抑制相关T淋巴细胞的功能，如CD8+毒性T淋巴细胞等，从而导致肿瘤细胞逃避免疫监视[30]。在胰腺导管腺癌肿瘤微环境中富含Treg细胞，这些细胞的表达抑制了肿瘤相关抗原特异性的CD8+T细胞的募集和活化。此外，肿瘤组织内Treg细胞的浸润与胰腺癌细胞的分化程度相关且提示预后不良，为胰腺癌的独立预后因子[31]。研究同时发现原位肿瘤外周间质Treg细胞低表达，这使得胰腺外周间质炎性反应增强，引起肿瘤周围正常组织屏障功能破坏，为肿瘤转移提供有力条件。

Morse等[32]研究表明，地尼白介素（denileukin⁃diftitox）在体外实验中可降低外周循环中CD4+CD25（high）FoxP3（+）Treg的表达水平，活化效应T细胞；临床研究显示，胰腺癌患者接受白介素注射治疗后回输体外经rF-CEA（6D）-TRICOM载体负载的树突状细胞（dendritic cells，DCs）抗肿瘤疫苗处理后，流式分析结果显示外周血内Treg的含量显著降低，T淋巴细胞增殖数目增加，ELISPOT结果显示体内针对CEA抗原的细胞毒性反应明显增强，提示机体内抗肿瘤活性增强。也有研究表明，通过腹腔注射竞争性抗糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（glucocorticoid induced TNF receptor，GITR）单克隆抗体联合干扰素α（interferon，IFN-α），可显著抑制胰腺肿瘤组织内Treg细胞的浸润，并显著上调肿瘤组织内CD4+和CD8+的T细胞数目，从而抑制小鼠皮下瘤体的生长[33]。胰腺癌中重要的化疗药物吉西他滨在体内的作用机制也是通过减少胰腺癌荷瘤小鼠体内Treg细胞含量，增强小鼠的抗肿瘤活性，延长治疗组小鼠生存时间[34]。此外，Shibuya等[35]研究报道与小鼠胰腺癌模型不同的是，胰腺癌患者外周血髓样细胞的功能缺陷更为突出，新辅助治疗可有效降低髓样细胞在肿瘤内的浸润水平而发挥有效的抗肿瘤作用。综上所述，将重塑Treg这类免疫抑制细胞联合传统的化疗，可在改善胰腺癌患者机体免疫力的前提下，增加化疗药物在肿瘤组织内渗入，提高化疗药物的疗效。

3 胰腺癌免疫检查点相关靶向治疗策略

上述提示肿瘤免疫抑制细胞，其作用较多是通过抑制T细胞的杀伤功能发挥作用。然而，除了上述“重塑”、“再教育”免疫抑制细胞的治疗策略研究外，肿瘤免疫检查点抑制剂为潜在的新途径。

细胞毒T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T lym⁃phocyte-associated antigen-4，CTLA-4），ipilimumab是CTLA-4人源化IgG1单克隆抗体，通过阻挡免疫抑制信号，不仅可以诱导CD8+T淋巴细胞扩增，也扩大了CD4+效应T细胞的数量来加强免疫反应。Hingorani等[17]报道了一项ipilimumab单臂Ⅱ期临床试验，有20例转移性胰腺癌和7例局部进展期胰腺癌患者接受ipilimumab治疗后，无患者出现疾病缓解，但1例受试者获得肿瘤延迟退缩，提示单药ipilimumab对晚期胰腺癌的治疗无效。tremelimumab是抗CTLA-4的人源IgG2单抗，其在胰腺癌的临床试验正在开展中。上述提到完全耗竭胰腺癌模型鼠中的肿瘤相关成纤维细胞（carcinoma-associated fibroblasts，CAFs）后，小鼠表现为肿瘤恶性程度增强，生存时间缩短。然而，当研究者再次加用CTLA-4单抗ipilimumab处理PSCs耗竭的肿瘤模型鼠的生存率却得到了显著提高[10]。另一项Ⅰb期单臂试验[36]用于明确ipilimumab单药或联合应用GM-CSF疫苗GVAX时对既往治疗过的胰腺癌患者的疗效和安全性，结果显示联合用药组的生存预后更好（中位OS 3.6个月vs.5.7个月）。提示抗CTLA-4单抗结合其他化疗、免疫治疗等，可能对疾病缓解有效。

与CTLA-4类似，当细胞毒T细胞上的PD-1（programmed death 1）分子与肿瘤细胞表面的PD-L1（programmed death ligand 1）配体结合时，抑制T细胞激活，使得肿瘤细胞能逃脱免疫系统的杀伤。近年本课题组评估了PD-1/PD-L1表达与临床病理之间的关系，结果显示胰腺癌中PD-L1高表达与淋巴转移呈正相关，并且与分化水平呈负相关，而肿瘤浸润性T细胞膜上PD-1高表达与分化和T分期呈正相关，高表达PD-1预示着患者OS更长，与其他肿瘤的相关研究结果相吻合[37]。提示PD-1/PD-L1与胰腺癌预后相关，靶向PD-1/PD-L1免疫治疗可延长肿瘤发展。然而，一项关于抗PD-L1单抗的Ⅰ期试验，包括14例胰腺癌在内及其他恶性肿瘤共207例患者，未观察到客观缓解的胰腺癌患者，提示单药在胰腺癌应用中的临床意义非常有限[38]。另有研究分析，对于抗PD-1单抗药物的敏感性与肿瘤患者体内PDL1的表达量有关，筛选合适的目标人群可能会取得较好的疗效。

目前，备受关注的免疫治疗在实体瘤中的研究屡受挫折，深入了解免疫治疗失败的机制，克服治疗耐受将是亟需解决的问题。近年来Wei等[39]研究表明，CTLA-4与PD-1抗体分别靶向不同亚型的淋巴浸润细胞，其中抗PD-1主要诱导特异性肿瘤浸润的CD8+T细胞亚群的增殖。与此相反，抗CTLA-4可诱导ICOS+Th1样的CD4+效应细胞的扩增，同时也能招募特定的CD8+T细胞亚群，两者通过独特的方式起到杀伤肿瘤的作用，两者联合应用可能会取得更好的疗效。因此，关于PD-1/PD-L1以及抗CTLA-4抗体之间的联合或者与其他化疗、肿瘤疫苗等治疗方法联合也在新的试验探索中。

4 总结及展望

目前，临床应用的药物主要针对胰腺癌细胞本身，而胰腺癌组织内显著的免疫抑制状态，影响了化疗药物抗肿瘤作用。因此,许多研究者证实选择同时针对肿瘤细胞以及靶向重塑肿瘤微环境双重治疗策略，可以得到更高疗效抗肿瘤策略。

胰腺癌标准的化疗药物或是目前研究火热的免疫治疗，似乎均不能大幅度提高患者应答率。因此，深入了解治疗失败背后的机制，克服治疗耐受也是亟需解决的问题。胰腺癌具有高度异质性，患者往往初始用药有效但很快就产生耐药。因此，若胰腺癌的治疗仅关注靶向肿瘤细胞本身的策略，可能忽略了为肿瘤细胞提供各种有利条件的微环境在肿瘤发生发展中的重要作用。因此，靶向微环境的治疗策略可弥补当前治疗的这一缺陷，两者结合可针对肿瘤细胞和微环境双管齐下，抑制肿瘤生长，从而延长患者OS。然而，多种策略联合的方式，包括目前正在临床研究的化疗药物与免疫治疗的合并应用，无疑会给胰腺癌患者带来更为严重的不良反应。因此，在今后的研究中希望能够综合不同治疗方法，取长补短，改变以杀灭癌细胞为主的策略，注重胰腺癌微环境的调整，合理应用免疫调节，并特别关注患者体能，将最终可能达到延长患者OS和提高生存质量的目标。

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