PRRSV非结构蛋白抑制宿主先天性免疫的分子机制

徐善之 田质高 陈 飞

（张家港出入境检验检疫局，江苏张家港 215600）

猪繁殖和呼吸障碍综合征，俗称“蓝耳病”，是由猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）引起的一种急性烈性传染病，其于1987年在美国中西部地区首次被发现并报道。1996年我国学者第一次从国内PRRSV血清阳性猪群中分离到该病毒[1]，随后该病毒传播至全国各地并于2006年出现高致病性毒株[2,3]。PRRSV属于套式病毒目、动脉炎病毒科、动脉炎病毒属的单股正链RNA病毒，约15.4 kb，包含至少10个开放阅读框，通过2个移码位点至少编码16个非结构蛋白和8个结构蛋白[4]。猪是PRRSV的唯一宿主，PRRSV感染后主要侵害猪肺脏的肺泡巨噬细胞。

先天免疫是机体防御病原微生物感染的第一道防线，其在病毒早期的感染过程中发挥了重要作用。干扰素是先天免疫的重要组成部分，具有抗病毒、影响细胞生长、分化以及调节免疫反应等多种生物学功能。现在通用的分类方法将干扰素分为三种类型：Ⅰ型主要包括IFN-α 和 IFN-β，其中 IFN-α 具有多种亚型，IFN-β仅有一个亚型；Ⅱ型只有 IFN-γ；Ⅲ型即IFN-λ1（IL-29）、IFN-λ2（IL-28a） 和 IFN-λ3（IL-28b），最近又刚发现了IFN-λ4[5,6]。其中，Ⅰ型干扰素在抗病毒感染过程中发挥了重要作用，然而PRRSV编码了多种非结构蛋白（Nsp1、Nsp2、Nsp4、Nsp11）抑制了Ⅰ型干扰素的产生并采取了多种策略干扰了其下游的信号转导通路，从而引起了宿主明显的免疫抑制现象。

1 PRRSV-Nsp1拮抗Ⅰ型干扰素介导的先天免疫的机制

PRRSV的非结构蛋白 1（Nsp1） 自身剪切为Nsp1α和Nsp1β两个蛋白，这两个蛋白都具有很强的抑制干扰素的能力。IRF3是先天免疫反应信号通路中一个重要的转录因子，其被磷酸化后入核，随即刺激IFN-β的产生。Kim等[7]研究表明，Nsp1α可以通过降解细胞核内的CBP来抑制IFN-β的产生，尽管Nsp1α不能抑制IRF3的磷酸化和核转移，但Nsp1α引起的CBP的降解减少了CBP与IRF3的结合，从而不能在核内形成转录增强复合体，最终导致IFN-β的产生受阻。Song等[8]进一步研究表明Nsp1α蛋白C末端的锌指结构区域是抑制干扰素的转录关键区域，尤其是C末端的14个氨基酸，Shi等[9]通过突变C末端的一系列氨基酸表明F176为抑制IFN的关键氨基酸。

Beura等[10]研究表明，Nsp1β可以通过抑制IRF3的磷酸化以及JAK/STAT信号通路来影响宿主的先天性免疫反应。Nsp1β可以诱导KPNA1蛋白的降解，进而影响了STAT1的入核，抑制了干扰素刺激基因（ISGs）的表达，进一步研究表明Nsp1β的第19位氨基酸是诱导KPAN1的泛素化降解和抑制干扰素介导的信号转导的关键氨基酸。此外，Song等[8]发现Nsp1α 和Nsp1β能够抑制IκB的磷酸化，从而抑制IκBα的降解，影响了NF-κB的释放和入核，进而影响了干扰素的产生。

2 PRRSV-Nsp2拮抗Ⅰ型干扰素介导的先天免疫的机制

PRRSV的非结构蛋白2（Nsp2）是其基因组编码的分子量最大、也是最易变异的蛋白，其参与病毒感染过程中的多个环节并发挥重要功能。Nsp2主要由N端的半胱氨酸蛋白酶区域、中间的高变区、C端的跨膜区以及高度保守的富含半胱氨酸残基的功能未知区域四个区域组成。其中Nsp2 N端的半胱氨酸蛋白酶具有切割活性，另外其也属于卵巢肿瘤蛋白酶超家族，具有去泛素化酶（DUB）的活性，Nsp2的DUB可以抑制IRF3和NF-κB的先天性免疫信号通路的激活，从而抑制干扰素的产生，另外还可以抑制干扰素刺激基因ISG15的表达及其他抗病毒蛋白的ISG化来抵抗宿主细胞的抗病毒作用。

IRF3是先天免疫反应信号通路中一个重要的转录因子，其被磷酸化后入核，随即刺激IFN-β的产生。Nsp2的半胱氨酸蛋白酶区可明显抑制IRF3的磷酸化及其进一步的入核，进而抑制了IFN-β的产生。同IRF3一样，NF-κB也是先天免疫反应信号通路中一个重要的转录因子，在正常情况下，其与IκB家族成员的分子结合在细胞质中。在受到刺激时候，将会激活IκB激酶而使IκB分子磷酸化继而通过泛素蛋白酶体途径被降解，此时NF-κB被释放入核，刺激下游干扰素及其他细胞因子的产生。Nsp2半胱氨酸蛋白酶功能域通过其去泛素化功能抑制了IκBα多聚泛素体的降解，影响了NF-κB的释放和入核，进而影响了干扰素的产生。ISG15是一个由I型干扰素诱导产生的泛素化样蛋白，在细胞中以自由分子或与其他蛋白偶联的形式存在，在天然免疫中发挥着重要作用，Nsp2抑制了干扰素的产生从而下调了ISG15的表达，另外Nsp2通过其半胱氨酸蛋白酶功能域的去泛素化功能抑制了其他抗病毒蛋白的ISG化，从而抵抗了宿主细胞的抗病毒作用。

3 PRRSV-Nsp4拮抗Ⅰ型干扰素介导的先天免疫的机制

PRRSV的非结构蛋白4（Nsp4）具有3C样丝氨酸蛋白酶活性，在病毒增殖过程中对病毒蛋白表达及加工起核心作用，能够水解多聚蛋白pp1a/pp1ab，产生Nsp3至Nsp12共10种成熟的非结构蛋白。关于PRRSV-Nsp4抑制I型干扰素产生的分子机制，文献报道主要是通过Nsp4本身的蛋白酶活性切割接头分子MAVS和NEMO，阻碍了IRF3和NF-κB的活化进而抑制了IFN-β的激活。另外，陈智比较了高低致病性PRRSV毒株Nsp4对IFN-β的抑制能力，发现Nsp4的亚细胞定位也可能与IFN-β的转录水平有关。

线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）是先天免疫信号通路中一个重要的接头分子，它的活化将激活核转录因子必须调节基因NEMO以及TANK结合激酶1，进而激活转录因子NF-κB和IRFs，刺激IFN-β的产生。董剑鸣研究表明，PRRSV-Nsp4底物的酶切位点有一定的特异性，即通过识别底物Glu-Gly、Glu-Ala和Glu-Ser残基位点特异性切割底物。其可通过识别MAVS的第268位氨基酸切割MAVS，切割后的两个片段（1-268和269-540）都不能有效诱导IFN-β的产生。Huang等研究表明，Nsp4通过识别NEMO的第349位氨基酸切割NEMO，进而影响了其下游通路，抑制了IFN-β的产生。另外，陈智发现高低致病性PRRSV毒株Nsp4存在两个保守的氨基酸位点差异，其试验结果表明Nsp4的第155位氨基酸是影响Nsp4抑制IFN-β转录的关键位点。

4 PRRSV-Nsp11拮抗Ⅰ型干扰素介导的先天免疫的机制

PRRSV的非结构蛋白11（Nsp11）具有核酸内切酶活性，其含有一个具有内切核糖核酸酶功能的NendoU区。关于PRRSV-Nsp11抑制I型干扰素产生的分子机制，文献报道主要是Nsp11抑制了IRF3及IκBα的磷酸化，进而影响了干扰素的产生。Shi等研究表明Nsp11第129位的氨基酸残基参与了对IRF3磷酸化的抑制。Wang等研究发现Nsp11具有去泛素化的功能，其抑制了K-48位连接的IκBα多聚泛素体的降解，影响了NF-κB的释放和入核，进而影响了干扰素的产生。

5 讨论

猪繁殖和呼吸障碍综合征是影响我国乃至全球养猪业最为严重的疾病之一，但是由于其快速变异、持续感染、免疫抑制、诱导中和抗体水平低下、抗体依赖性增强作用（ADE）以及易引起继发感染等众多问题的存在，至今未找到一种有效安全的方式对其进行防控。俗话说“知彼知己，百战不殆”，只有清楚PRRSV的致病机理，才能针对性地探索其防控方法。本文综述了PRRSV利用其四种非结构蛋白逃逸宿主先天免疫的机制，就PRRSV致病、造成免疫抑制的原理做了总结，希望能为PRRSV的防控及新型疫苗及药物的研发提供新的路径。

[1]郭宝清,陈章水,刘文兴,等.从疑似PRRS流产胎儿分离PRRSV的研究[J].中国畜禽传染病,1996(2):3-7.

[2]Tian K,Yu X,Zhao T,et al.Emergence of fatal PRRSV variants:unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark[J].PLoS One,2007,2(6):e526.

[3]Zhou L,Yang H.Porcine reproductive and respiratory syndrome in China[J].Virus Research,2010,154(1):31-37.

[4]Kappes MA,Faaberg KS.PRRSV structure,replication and recombination:Origin of phenotype and genotype diversity[J].Virology,2015,479:475-486.

[5]McNab F,Mayer-Barber K,Sher A,et al.Type I interferons in infectious disease[J].Nature Reviews Immunology,2015,15(2):87-103.

[6]Prokunina-Olsson L,Muchmore B,Tang W,et al.A variant upstream of IFNL3 (IL28B)creating a new interferon gene IFNL4 is associated with impaired clearance of hepatitis C virus[J].Nature Genetics,2013,45(2):164-171.

[7]Kim O,Sun Y,Lai FW,et al.Modulation of type I interferon induction by porcine reproductive and respiratory syndrome virus and degradation of CREB-binding protein by non-structural protein 1 in MARC-145 and HeLa cells[J].Virology,2010,402(2):315-326.

[8]Song C,Krell P,Yoo D.Nonstructural protein 1α subunit-based inhibition of NF-κB activation and suppression of interferon-β production by porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].Virology,2010,407(2):268-280.

[9]Shi X,Chen J,Xing G,et al.Amino acid at position 176 was essential for porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)non-structural protein 1α (nsp1α)as an inhibitor to the induction of IFN-β[J].Cellular Immunology,2012,280(2):125-131.

[10]Beura LK,Sarkar SN,Kwon B,et al.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus nonstructural protein 1β modulates host innate immune response by antagonizing IRF3 activation[J].Journal of Virology,2010,84(3):1574-1584.

[11]Li H,Zheng Z,Zhou P,et al.The cysteine protease domain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus non-structural protein 2 antagonizes interferon regulatory factor 3 activation [J].JournalofGeneralVirology,2010,91(12):2947-2958.

[10]Chen Z,Zhou X,Lunney JK,et al.Immunodominant epitopes in nsp2 ofporcine reproductive and respiratory syndrome virus are dispensable for replication,but play an important role in modulation of the host immune response[J].Journal of General Virology,2010,91(4):1047-1057.

（部分参考文献略）