EBV相关性胃癌分子特征及可能的治疗策略

综述 审校

胃癌是在肿瘤部位、病理类型、分子特征等方面均存在显著异质性的肿瘤，其中在分子水平进行分型尤为困难。2014年癌症基因组图谱（TCGA）提出了新型胃癌分子分型，首次将胃癌在分子水平分为四型：EB病毒感染型、基因组稳定型、染色体不稳定型及微卫星不稳定型。其中EBV相关性胃癌（Epstein-Barr virusassociated gastric cancer，EBVaGC）因具有PD-L1/2扩增/过表达的分子特性，有望成为免疫治疗的适宜群体，成为近几年关注的焦点［1］。本文就已知的EBVaGC重要分子特征及其可能的治疗策略进行综述。

1 EBVaGC概述

EBV属于γ疱疹病毒，可导致鼻咽癌、伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤及部分胃癌［2］。1992年首次在胃腺癌细胞中检测到EBV，有研究证实EBV阳性胃癌约占胃癌的10%［1，3］。由于不同研究纳入的胃癌患者分期、病理特征等不同，EBV阳性胃癌的比例在不同报道中差别较大。临床诊断EBVaGC的“金标准”是采用原位杂交法在胃癌细胞中检测到EBV编码的小RNA。在人群中，EBVaGC易发生在男性患者、肠型胃癌、近端胃癌，患者预后较好［4-5］。

2 EBVaGC分子特征

2.1 PD-L1/2过表达

免疫检查点分子是近年研究的热点。肿瘤细胞表达的PD-L1和PD-L2能够作为配体与T细胞上的PD-1相互作用，抑制细胞毒性T细胞活化，从而帮助癌细胞逃避免疫监视［1，6］。TCGA报道指出，EBVaGC存在PD-L1/2过表达，其全基因组测序结果显示，15%的EBVaGC存在PD-L1和PD-L2基因扩增［1］。此外不同研究中对PD-L1的表达情况亦多有报道，约34%～52%EBVaGC患者的肿瘤细胞中可检测到PD-L1表达，45%～94%患者的肿瘤组织中有PD-L1阳性（PD-L1+）免疫细胞浸润，这些现象大多发生在弥漫型患者中。EBVaGC中，PD-L1阳性者较阴性者预后更差［6-8］。

EBVaGC常见肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrat⁃ing lymphocytes，TILs），大量研究认为肿瘤组织中多有CD8+T细胞浸润，此外Foxp3+、PD-1+淋巴细胞浸润。EBV阳性胃癌中，癌组织CD8+T细胞浸润现象与癌细胞表达 PD-L1 存在相关性［6-7，9］。有研究认为，EBVaGC患者总体预后较好正是因为招募了更多的淋巴细胞浸润所致［10］。

综上所述，大量研究证实了EBVaGC中PD-L1高表达的分子特征，揭示了其特殊免疫微环境可能与PD-L1表达存在相关性。而上述研究结果在指导治疗中是否能发挥作用仍有待深入探索。

2.2 PIK3CA突变

PIK3CA是PI3K/AKT通路重要的调节因子。根据TCGA的研究，EBVaGC另一重要特征是PIK3CA突变率较高（约80%），而胃癌其他三种分型中PIK3CA突变率仅3%～42%［1］。据报道，EBVaGC肿瘤组织中PIK3CA的基因型有3～5种（包括野生型），且突变具有较高的瘤内异质性［11］。已有研究表明，PIK3CA突变可能先于EBV感染，机体感染EBV后通过病毒蛋白LMP2A强化事先突变的PIK3CA功能以激活PI3K/AKT通路，从而促进胃癌细胞增殖［12］。

临床病理特征方面，携带PIK3CA突变或PI3K/AKT通路关键分子突变的EBVaGC常发生于胃体中部［13］。已有研究证实PIK3CA激活突变和pAKT表达增加与胃癌患者预后不良及抗HER2治疗耐药有关，但其对EBVaGC的影响仍有待深入研究。

综上所述，PIK3CA突变率高是EBVaGC的一个分子特征；PIK3CA突变与EBV蛋白产物相互作用激活PI3K/ATK通路可能是EBVaGC发生的机制之一；PIK3CA对患者预后和临床治疗的影响已有一些研究，但总体上缺乏针对性。据此推断靶向PI3K/AKT通路的抑制剂有望成为EBVaGC治疗的策略之一。

2.3 ARID1A突变

ARID1A是SWI/SNF染色质重塑复合物的一个亚基，通过调节染色质结构和基因表达发挥肿瘤抑制作用。EBVaGC中ARID1A突变率为55%，突变导致其表达缺失［1］。与PIK3CA突变类似，ARID1A突变可能也早于EBV感染，突变的ARID1A导致染色质结构改变，可能是造成病毒进入细胞核以及后续致癌机制（如操纵抑癌基因启动子甲基化）的原因［12，14］。

ARID1A突变对胃癌预后的影响一直存在争议，近期一项荟萃研究分析显示，ARID1A表达缺失与EBV阳性胃癌的不良预后相关［14］。由于荟萃分析中纳入的患者各方面特征均有差别，若要获得ARID1A突变与特征明确的某些胃癌患者预后的关系，有必要进一步大样本研究。ARID1A在EBVaGC中的高突变率及其可能致癌机制的研究，或许能够提供EB⁃VaGC治疗的新思路。

2.4 DNA超甲基化

DNA甲基化异常是肿瘤发生的重要事件之一，EBVaGC中存在DNA CpG岛超甲基化。有研究表明，EBV感染后产生的病毒产物LMP2A可能导致DNA甲基转移酶1、3b（DNMT1、DNMT3b）的激活［1，15-16］，促使基因启动子甲基化从而引发基因表达下调，如生长抑素受体1（SSTR1）［17］、抑癌基因PTEN［15］、CDKN2A（p16）［18］、p73［19］、REC8［20］等。甲基化引发上述基因的沉默机制及在后续肿瘤发生中扮演的角色尚需深入探讨，EBV感染后引发的启动子甲基化抑制众多抑癌基因表达，可能是EBVaGC发生发展的机制之一。

2.5 TP53突变

TP53基因是抑癌基因，编码的核蛋白p53可作为转录因子参与维持基因组稳定。既往研究中，TP53突变是胃癌中最为普遍的基因改变事件，尤其在染色体不稳定型胃癌中TP53频发突变，p53表达上调。然而EBVaGC却罕有TP53突变，本研究分析可能是野生型p53在EBV早期致癌过程中发挥作用，在中晚期则被病毒产物降解而失去其抑癌作用。因此，EB⁃VaGC中野生型p53的促癌作用可能是其TP53突变率低的原因。在预后方面，有报道［1，21］EBVaGC p53阳性者无病生存期较p53阴性者明显缩短。TP53低突变是EBVaGC的一个分子特征，对其机制及影响的进一步深入探索是必要的。

3 EBVaGC的可能治疗策略

3.1 靶向免疫检查点抑制剂

近年，免疫检查点PD-1、PD-L1单抗在肿瘤治疗中取得一定进展，尤其在黑色素瘤、非小细胞肺癌的临床治疗中效果显著［22］。EBVaGC患者因其PD-L1高表达这一特征，能否成为免疫治疗的获益群体尚需进一步临床研究证实。

目前，两种PD-1/PD-L1单抗pembrolizumab（MK-3475）和nivolumab（BMS-936558）在胃癌中的临床效果正在观察中。对于pembrolizumab，一项针对PD-L1阳性进展期胃癌患者的临床试验中，41%的可评估患者显示肿瘤缩小，39例患者总体反应率为31%，初步数据显示肿瘤组织PD-L1表达与总体反应率无显著相关性（NCT01848834）；在此基础上的Ⅱ期试验现已开展（NCT02589496）。对于nivolumab，在胃癌中的临床试验均在进行中，研究内容涉及药物对EBVaGC的安全性和有效性评估（NCT02488759），nivolumab单药及联合iplimumab在胃癌中的有效性研究（NCT01928394），以及针对难治性/标准化治疗不耐受的进展期及复发胃癌的相关研究（NCT02267343）等［23-24］。除上述两种单抗，已有众多PD-1/PD-L1抗体在胃癌中进行相关的临床试验。包括针对实体肿瘤PD-L1及其负性调控分子VISTA的Ⅰ期研究（NCT02812875）［25］，以及MPDL3280A、MEDI4736的 Ⅰ/Ⅱ 期临床试验（NCT01375842，NCT01693562）等［24］。

针对免疫检查点的治疗除靶向抑制剂外，基于基因编辑CRISPR-Cas9技术介导的过继治疗也有望成为一种新的免疫治疗策略。有研究表明，破坏T细胞表面PD-1受体，可使其对EBV+胃癌细胞系杀伤效果增强；PD-1破坏的T细胞与低剂量放疗联合，在EBVaGC小鼠移植瘤模型中抗肿瘤效果显著增强［26］。基于上述思路设计的一项在进展期EBVaGC中开展的Ⅰ/Ⅱ期临床试验正在进行中（NCT03044743）。

综上所述，EBVaGC中免疫检查点相关的研究目前大多集中于PD-L1在患者中的表达情况、临床病理特征及其与TILs的关系等方面；但是对于治疗，靶向抑制剂确切的有效性和安全性受样本量等因素限制仍有待探索，EBVaGC患者因其PD-L1高表达及TILs等特性是否能够作为获益人群尚不明确，EB⁃VaGC的针对性研究亟待进行。

3.2 靶向PI3K/AKT通路抑制剂

EBVaGC的PIK3CA突变导致PI3K/AKT通路激活可能是一种致癌机制，靶向抑制该通路关键分子是可能的治疗策略。作为HER2下游信号通路之一，在HER2阳性胃癌中，该通路的活化与HER2靶向药物曲妥珠单抗耐药有关，靶向该通路的抑制剂具有一定的抗肿瘤活性并可逆转曲妥珠耐药［27］。在EB⁃VaGC中，PI3K/AKT/mTOR通路抑制剂（BEZ235、LY294002）单药或联合化疗在体外细胞实验中对EBV+胃癌细胞系也具有抑制增殖作用［24，28］。

mTOR抑制剂everolimus虽然在进展期胃癌的临床研究中宣布失败，但在某些患者中疗效显著，有研究表明pS6可能是everolimus的疗效预测标志物（NCT00 729482）［29］；此外有针对PIK3CA突变肿瘤患者的研究：PI3K抑制剂BYL719（NCT01613950，NCT01708161）、AKT抑制剂AZD5363联合紫杉醇（NCT 02451956）、mTOR抑制剂sirolimus（NCT02449564）等相关临床试验。上述研究均未明确患者是否具有EBV感染，且均未得到令人满意的结果。

因此，虽然既往研究中靶向PI3K/AKT/mTOR通路的抑制剂在胃癌临床前研究中显示一定的抑癌作用，但临床试验的结果并不理想。针对EBVaGC中PIK3CA激活突变的治疗策略，除靶向抑制其通路关键分子外，PIK3CA突变位点的靶向治疗或许能够成为下一步的研究方向。EBV感染可能作为PI3K/AKT通路抑制剂筛选获益人群的一个条件，但仍需进行更有针对性的研究以完善相关抑癌策略。

3.3 抗病毒治疗

EBV以潜伏期状态感染宿主，表达各种蛋白作用于机体，参与肿瘤的发生发展。部分病毒随后可由潜伏期转为裂解期以完成增殖，此时将造成宿主细胞死亡。因此根据EBV的生物学特点，EBVaGC一个可能的治疗策略是诱导潜伏期病毒进入裂解期，即EBV将自身作为靶标对癌细胞产生靶向杀伤效果［30］。可能的诱导剂包括：1）传统化疗药物，如5-氟尿嘧啶、顺铂、紫杉醇等，通过p38MAPK、MAP/ERK和PI3K信号通路的参与，发挥癌细胞杀伤效应，联合更昔洛韦可产生显著的协同效应［31］；2）组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）抑制剂，如罗米地辛［32］、丙戊酸［30］等。临床上，目前已有HDAC抑制剂苯丁酸联合更昔洛韦抗EBV肿瘤的Ⅱ期研究（NCT00387530），以及其他裂解诱导剂相关的研究（NCT00982449，NCT02080416）等［18］。

4 结语

根据上述研究，已报道的EBVaGC分子特征包括：PD-L1/2过表达，PIK3CA突变，ARID1A突变，DNA超甲基化及TP53低突变等。EBVaGC可能的致癌机制为：PD-L1过表达帮助肿瘤细胞免疫逃逸；PIK3CA突变激活PI3K/AKT信号通路促进肿瘤细胞增殖；ARID1A突变导致细胞染色质结构改变以帮助EBV进入胞核；DNA超甲基化致使众多抑癌基因沉默以及野生型p53蛋白参与EBV相关的致癌过程等。EBVaGC可能是上述多种机制共同作用的复杂结果。随着研究的深入，可能还会发现EBVaGC的更多分子特征，对以上各分子特征及相关致癌机制的研究仍需更多证据，对其指导治疗的意义更需后续探索。目前，相关的免疫、靶向等治疗策略缺乏对EBVaGC的针对性研究。后续可通过体内、外实验进一步探索下述问题，如EBVaGC中PD-L1/2表达与TILs的关系、对PD-L1单抗的反应；PIK3CA突变所产生的影响、与EBV蛋白产物的相互作用及对相关靶向药物的反应；ARID1A突变及其影响等。

综上所述，EBVaGC具有PD-L1高表达、PIK3CA频发突变等分子特性，可能与临床预后、致癌机制等具有相关性，进一步发掘并深入研究其分子特征对制定适宜的治疗策略具有指导意义。

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