PCR-DGGE技术及其在猪肠道微生物菌群变化的研究进展

侯美如 尹珺伊 王 岩 刘 宇 陈楠楠 秦平伟 冯万宇 张 艳 史同瑞

（黑龙江省兽医科学研究所，黑龙江齐齐哈尔 161006）

动物肠道菌群是一个非常复杂多样的生物群体。以哺乳动物为例，其肠道微生物分属400多种不同的微生物，每克大肠内容物的细菌含量高达1010个。这些微生物相互依赖、相互制约，对宿主的健康和物质的营养代谢起着重要的作用。因此，动物肠道菌群的组成及相互作用，和肠道功能的健康有着密切的联系，但传统的微生物鉴别方法，是以细菌分离、培养为基础，进行染色镜检，生化鉴定，由于在肠道中90%以上的微生物是严格厌氧菌，培养条件苛刻，仅有少数可在实验室条件下被分离纯化，往往不能客观、真实地反映肠道菌群数量及多样性[1-2]。

分子生物学的发展及基因库的不断完善，为细菌多样性分析提供了有效的技术手段，如rRNA/rDNA序列分析、随机扩增多态性分析（RADP）、限制性内切酶酶切片段长度多态性分析（RFLP）、变性梯度凝胶电泳（DGGE）等。这些技术的出现弥补了传统研究方法的不足，同时提供了一种对微生物群落进行定性描述和定量分析的方法，为研究微生物的种族发育关系提供了科学的分类依据。

变性梯度凝胶电泳（Denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE），是由Fisher等人1983年创立并用于检测DNA突变的技术。随后，Muyzer等人在1993年首次将该技术用于研究土壤的微生物区系，结果证实了该技术在研究微生物菌群分析和多样性方面的优势[3]。

1 PCR-DGGE技术的基本原理

在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳中，双链DNA的分子大小和电荷是影响其迁移行为的主要因素。根据迁移行为的差异，便可对不同大小的DNA片段进行区分，同样大小的DNA片段由于迁移行为相同，而无法被区分。PCR-DGGE技术在普通聚丙烯酰胺凝胶配方的基础上，增加了尿素和甲基酰胺，形成变性梯度凝胶。

序列组成不同的双链DNA片段，具有不同的解链区域及其不同解链区域的解链浓度。在DGGE电泳过程中，凝胶浓度呈现梯度变化，变性浓度由低至高，浓度最初比较低，无法达到双链DNA片段最低的解链区域而完成解链，DNA片段的这段迁移行为与在一般的聚丙烯酰胺凝胶中是一样的；随着变性浓度的变化，当DNA片段到达一个特定的浓度位置，变性浓度满足双链DNA片段最低的解链区域解链时，DNA片段便发生解链。

由于DNA片段发生部分解链，其在凝胶中的迁移速率急剧下降。因此，序列不同而长度相同的DNA片段将在各自特定的凝胶浓度位置上发生解链行为，根据它们在凝胶的不同位置而被分开。

当DNA片段在其最高解链区域的变性浓度时，将完全解链成单链分子，它们将在凝胶中继续迁移。当同等长度、不同序列的DNA片段的差异序列存在于最高的解链区域时，便无法将它们区别开来。GC片段夹子的引入，使最高解链区域转为GC夹子处，而GC夹子的解链变性浓度很高，从而避免了DNA分子被完全解链为单链分子的问题，使存在差异序列的DNA片段基本上都能被区分开来。

2 DGGE在猪肠道微生物菌群变化的研究应用

2.1 不同时间点胃肠道菌群变化

Simpson等[4]首次运用PCR-DGGE技术分析猪肠道微生物菌群，研究随着猪年龄和日粮的变化，不同个体的肠道及粪样微生物菌群的结构差异。从图谱上发现，在断奶前后及育肥期，猪肠道微生物菌群存在差异，都具有特殊条带，且断奶对猪肠道细菌种群影响较大。

朱伟云等[5]对12头仔猪从断奶第1天开始采集粪样，采用DGGE技术对粪样中的细菌菌群变化进行跟踪，结果显示，仔猪断奶后粪样中的细菌群落迅速发生了复杂的变化，相似度分析也证实了断奶第1天和断奶后第13天粪样细菌群落发生很大变化。一些在仔猪断奶后第1天出现的优势条带在断奶后第6天消失，很多条带于断奶后第13天消失，与此同时，在断奶后第6、7或13天一些新的条带陆续出现，随时间延长，条带的数量逐渐增多。

Janczyk等运用DGGE技术对仔猪回肠食糜样品进行分析，在断奶后1～2天出现唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）条带，在断奶后第1天和第11天出现卷曲乳杆菌（Lactobacillu scrispatus）所对应的条带，Lactobacillus sobrius为所有动物的DGGE图谱中最优势条带的相似菌。

2.2 不同位置内容物菌群的变化

Simpson等[6]采集1头5月龄仔猪不同肠道位置的内容物及其黏膜样本，经DGGE图谱分析，除盲肠外，其他位于同一肠段的内容物及其黏膜处具有相近的图谱，不同肠道位置的图谱存在较大差异，位置相距越远，之间的相似性指数就越小，由此可以发现不同部位肠道菌群分布存在差异，解剖结构相距越远，菌群相似度越低。

吴高锋[7]应用PCR-DGGE技术对两窝（A、B两组）共16头不同时间段的健康仔猪不同肠段（十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠）位置中的微生物菌群结构多样性及其动态变化进行了研究，发现出生后数小时的仔猪（未吃初乳）肠道便有少量细菌定植，随着日龄的逐渐增长，仔猪不同肠段中的细菌种类及数量也随之增多。3日龄仔猪肠道就已经存在了相当丰富的细菌种类及数量。肠道中细菌种类及数量到9日龄、15日龄时变化逐渐变缓，20日龄有所增加，但28日龄又有所下降，35日龄逐渐趋于稳定。在各肠段中，十二直肠及空肠的细菌种类和数量是相对较少的，以盲肠及结肠为最多。

2.3 外源添加物对胃肠道内容物细菌群落的影响

Collier等[8]于2003年运用PCR-DGGE技术研究日粮添加抗菌素对猪回肠微生物区系的影响。抗菌素的添加可有效抑制肠道中部分细菌的生长，减少了因肠道免疫应答而引起的营养物质和能量的消耗。从图谱中亦可以看出，添加抗菌素组的肠道细菌条带数量和总DNA浓度减少。同时，在添加抗菌素的过程中，猪肠道中的细菌总数明显降低，而乳酸菌的数量明显增加，进一步证明抗菌素可以明显促进猪只生长。

Konstantinov等[9]运用DGGE技术研究甜菜渣和果寡糖等可发酵碳水化合物对仔猪粪样菌群多样性的影响，结果表明，饲喂组与对照组相比，仔猪粪样中菌群多样性增加，并且其细菌区系也较快达到稳定。经分析DGGE图谱中的13条优势条带与Clostridium coccoides和Clostridium leptum的相似度为91%～97%，由此推测，这些细菌可能在仔猪利用日粮纤维上起了作用。同样朱伟云等的研究[5]对3窝12头仔猪分别饲喂3种不同的日粮，以基本日粮配果寡糖及甜菜汁的b组，在断奶第1周内仔猪粪样中的细菌群落发生急剧变化而后缓慢变化，其推测可能与其日粮中果寡糖有关。

Wang[10]等运用DGGE技术研究饲喂全株水稻后猪结肠内容物和粪样中菌群的组成，发现饲喂全株水稻日粮的猪粪样样品的DGGE图谱条带数量和Shannon多样性指数显著增加，但随着日粮中全株水稻比例的增加，其结肠内容物样品的DGGE条带数量和多样性指数却逐渐较少。

针对猪场中采用“早期补饲、早期断奶”的饲养模式而引起的仔猪腹泻问题，姚文等[11]利用PCR-DGGE结合16S rDNA序列技术，通过研究该饲喂模式下仔猪肠道中微生物种群的动态变化情况，科学阐明了微生物变化与仔猪腹泻的关系。研究表明，仔猪饲喂开食料前，肠道微生物的优势谱带为单一的大肠杆菌；饲喂开食料后，仔猪肠道微生物区系变得复杂且多样，但这种变化较为短暂，导致仔猪呈现短期腹泻的症状。断奶后仔猪肠道微生物图谱多样性指数稳定，稳定的微生物区系多样性可缓解断奶后仔猪应激产生的腹泻症状，随着仔猪日龄的增长，肠道中微生物区系组成也逐渐稳定。

3 展望

PCR-DGGE技术在微生物区系分析中，具有较大的优势，无需进行微生物培养，打破了不可培养微生物的限制。在自然界中尚不可培养的微生物占比85%～99%，而一些可培养的微生物对生长环境要求较为苛刻，给多态性和动态分析带来了限制。DGGE技术还可以与其他方法结合，如传统培养技术、克隆测序技术、杂交技术、实时荧光定量PCR技术，更加全面系统地展示微生态菌落的构成及优势菌群的分析，更加真实地反映微生物群落结构和功能的本质。

[1]Zoetendal EG,Collier CT,Koike S,et al.Molecular ecological analysis of the gastrointestinal microbiota:a review[J].Journal of Nutrition,2004,134(2):465-472.

[2]Savage DC.Microbial ecology of the gastrointestinal tract[J].Annual Review of Microbiology,1977,31(31):107-133.

[4]Mccracken VJ,Simpson JM,Mackie RI,et al.Molecular ecological analysis of dietary and antibiotic-induced alterations of the mouse intestinal microbiota[J].Journal of Nutrition,2001,131(6):1862-1870.

[5]朱伟云,姚文,毛胜勇.变性梯度凝胶电泳法研究断奶仔猪粪样细菌区系变化[J].微生物学报,2003,43(4):503-508.

[6]Simpson JM,Mccracken VJ,White BA,et al.Application of denaturant gradient gel electrophoresis for the analysis of the porcine gastrointestinal microbiota[J].Journal of Microbiological Methods,1999,36(3):167-179.

[7]吴高锋.应用PCR-DGGE技术对不同日龄仔猪肠道菌群分布规律的研究[D].郑州:河南农业大学,2009.

[8]Cocolin L,Manzano M,Cantoni C,et al.Denaturing gradient gel electrophoresis analysis of the 16S rRNA gene V1 region to monitor dynamic changes in the bacterial popularion during fermentation ofItalian sausages [J].Applied and Environmental Microbiology,2001,67(11):5113-5121.

[9]Konatantinov SR,Zhu WY,Willians B A,et al.Effect of fermentable carbohydrates on piglet fecal bacterial communites as revealed by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of 16S ribosomal DNA[J].FEMS Microbiology Ecology,2003,43:225-235.

[10]Wang HF,Zhu WY,Yao W,et al.DGGE and 16S rDNA sequencing analysis of bacterial communities in colon content and feces of pigs fed whole crop rice[J].Anaerobe,2007,13(3):127-133.

[11]姚文,朱伟云,毛胜勇.16S rDNA技术研究新生腹泻仔猪粪样细菌区系的多样性变化[J].微生物学报,2006,46(1):150-154.