中药发酵技术研究概况

王耀新，陈丽娜，韩国庆，王继明，杜芳

(内蒙古蒙肽生物工程有限公司研究院，内蒙古 呼和浩特 010000)

中药发酵是借助微生物的作用，在适当的温度、湿度、水分等条件下对药物进行发酵，改变其原有的特性，增强或产生新的药效，扩大应用范围，以满足临床用药需求的炮制方法[1]。我国人民早在4 000年前就利用发酵技术进行酿酒，继而人们在制酒曲的基础上加入不同的药物，发酵制成各种药用曲剂。早在东汉时期，张仲景的《金匮要略》就记载了发酵药“神曲”，以及北魏时期贾思勰的《齐民要术》《肘后方》《小品方》《千金方》等古籍医书中记有多种发酵炮制法的应用。倪朱谟的《本草汇言》中记载了多种发酵曲剂，如：南星曲、采云曲、沉香曲、半夏曲、红曲、女曲、建曲等。古籍医书中对发酵炮制药物的记录不胜枚举，流传至今仍在临床上使用的有20余种，在2005版《中国药典》收录的就有4种：半夏曲、百药煎、淡豆豉和六神曲(炒)。随着现代生物技术的发展，为传统的发酵炮制药物注入现代工艺，发酵条件更加可控，产品质量更加稳定，目前，主要应用的中药发酵技术可分为液体发酵和固体发酵，以及在固体发酵的基础上延伸发展而来的药用真菌双向发酵技术。

1 中药发酵技术的分类

1.1 液体发酵

液体发酵是基于抗生素生产工艺发展起来的现代中药发酵技术，也被称为深层发酵技术。主要技术手段是将发酵菌体或菌丝在生长状态良好的条件下，接种在培养基与中药材按合适比例混合好的培养液中，充分混匀后在合适温度、含氧量等条件下发酵培养，其产物包括发酵液和发酵菌体。液体发酵具有机械自动化程度高、物质传递效率高、生产成本低、生产条件可量化、产物稳定性高等优点，容易实现大规模工业化生产，因而有广阔的应用空间[2-3]。但与生产抗生素相比，大多数中药不具有直接的抗菌作用，生产过程易污染，对发酵罐等发酵设备、生产工艺要求高。

液体发酵技术通过对药材提取液或将药材粉碎后按合适比例配制成液体培养基，通过发酵菌的发酵，往往能起到增加有效成分含量或生物转化的效果。绿原酸是一种珍贵的中药药效成分，具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤、降血糖等功效，存在于植物细胞中，通过莽草酸途径合成。丁仁芳等[4]利用从金银花中分离到的内生枯草芽孢杆菌RP5对红薯叶发酵产绿原酸的研究中，通过对发酵条件的优化，以红薯叶提取物为发酵培养基，绿原酸的累积量可达54.60 mg/L，较红薯叶发酵培养基(本底水平)增加了2.24倍，较新鲜的红薯叶中本身绿原酸含量(18.32 mg/L)增加了2.06倍。积雪草有清热解毒、活血利尿的功效，临床上常由于治疗湿热黄疸、痈疮肿毒、跌打损伤等症，其有效成分三萜皂苷类中的积雪草酸的药物活性最高，但含量低，仅占积雪草质量分数约为0.90 mg/g。梅建凤等[5]用分离到一株黑曲霉(Aspergillus niger)JH-2菌株，在液体转化培养基中加入积雪草粉，通过液体发酵的方式完成了从积雪草苷到积雪草酸的转化，质量分数从0.90 mg/g提高到2.73 mg/g，是未转化的3.03倍。

1.2 固体发酵

固体发酵技术是在古代传统的制曲工艺上发展起来的，以农副产品或中药材作为发酵基质提供营养，利用一种或多种真菌为发酵菌种进行发酵的方法。其发酵条件自然开放，基质无需灭菌，发酵条件如温度、湿度、氧含量、pH值等都易于控制。虽然固体发酵在多种菌种共同发酵效果上并不亚于液体深层发酵，但因其体系开放，易污染其他杂菌，且缺乏科学的发酵终点判断指标和质量控制指标，多依赖制剂人的经验进行判断，难以实现大规模批量化生产。僵蚕是感染白僵菌而致死的干燥家蚕，是传统的名贵中药，应用广泛，但产量极低。刘学湘等[6]采用固体发酵技术，用白僵菌作为发酵菌种对蚕蛹进行发酵，不仅简化了操作步骤，优化发酵工艺后得到有效成分与生药僵蚕相比也大幅提升，而且为丝绸业的综合利用开辟了一条新途径。固体发酵开放的体系非常有利于复合菌株的联合发酵，刘洋等[7]以干酪乳杆菌、粪肠球菌和产朊假丝酵母三种益生菌联合固体发酵复方中药(王不留行和益母草)，将菌种、复方中药、农副产品营养物质和水按适当比例配制成湿态固体培养基，37℃下发酵72 h，其总黄酮、总生物碱、粗多糖和总皂苷含量分别比生药材提高了55.14%、127.28%、55.42%和49.21%。我国幅员辽阔，中药材品种繁多，品质不一，也导致固体发酵产出的产品品质参差不齐。因此固体发酵技术的发展应依赖于产品工艺的改良和质控指标的确立。

1.3 药用真菌双相发酵

药用真菌双向发酵技术是在固体发酵的基础上发展而来，将中药材或药渣替代固体发酵中农副产品做营养物质，中药材在为真菌提供营养物质的同时，受到真菌生长产生的各类生物酶的影响，真菌的代谢产物或细胞因子与中药材自身的结构、成分发生相互作用、相互影响，从而产生新的性味功能，因此具有双向性。双向发酵起源于上世纪八、九十年代，庄毅[8]指出用药性基质代替普通农副产品的营养基质，既提供药用菌生长所需的营养同时，药用菌又因生理作用分解或合成产生新的成分。槐耳具有显著的抗肿瘤、抗病毒功效，并且是被卫生部批准的临床广泛使用的抗癌药物；板蓝根作为清热解毒中药的代表，在抗病毒、解毒方面都有很好的效果，且板蓝根中的尿苷、次黄嘌呤等对抑制血小板凝集也有一定作用。张文意等[9]在槐耳板蓝根双向发酵的研究中，将活化的槐耳菌接种至板蓝根粉末为营养源的固体培养基中进行双向发酵，并用超高效液相色谱质谱联用法(UPLC-MS)对发酵过程中成分的变化进行检测。其板蓝根质控指标——表告依春及色胺酮、靛红等抗肿瘤、抗病毒的功效成分含量增加，丁香酸则含量降低，值得注意的是无论脂溶性还是水溶性成分都在发酵的生物转化作用下产生了新的化合物。朱舟等[10]对天南星采用白僵菌固体双向发酵,结果显示,天南星的形态和性状都发生改变，其毒性大大降低，生品天南星半数致死量(LD50)由(145.0±8.3)g/kg降低至(295.47±25.23)g/kg，但抗惊厥效果并无差异。不同药用菌因菌种差异的酶系统不同，不同药性基质因中药品种不同，所含成分也不尽相同，可见若能够实现药用真菌与中药材的有机结合，产生大量发酵组合，必然是中药发酵领域的后起之秀，但目前此法还缺少完整的科学理论支撑，仍有待进一步探索。

2 中药发酵技术在中药研究领域应用的优势

2.1 提高中药有效成分提取效率

中药材原料的取材范围广、种类多，其中植物源性药材占到中药材种类的90%[11]，起关键药效的有效成分主要存在于植物细胞的胞浆中，胞浆被细胞壁、细胞间质包裹在植物细胞的内部，而细胞壁为植物细胞特有的细胞器，是由纤维素、半纤维素、木质素、果胶质等物质组成的致密结构。如此坚实的结构，致使在提取中药材的有效成分时，需要突破细胞壁和细胞间质的双重阻力才能溶解于提取介质中。微生物无论是细菌还是真菌都有着强大的酶系，其生命活动产生的酶多到成百上千种，且酶活力强[12]，包括淀粉酶、果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶等，这些酶可以将植物细胞中的纤维素、半纤维素、果胶等致密成分分解、代谢，满足其自身营养需求，完成细胞的分裂和繁殖。与此同时，植物细胞壁的致密成分被降解后，结构疏松，细胞间隙增大，从而减小有效成分释放阻力，更容易扩散到提取介质中，从而起到简化提取工艺，增加提取效率的效果。贾艳姝[13]用保加利亚乳杆菌发酵黄芪，结果黄芪发酵后的总皂苷含量比黄芪粉煎煮液中增加了约22%，总黄酮含量增加了约13.6%。表明发酵使黄芪中的有效成分进一步释放。山楂、泽泻和决明子均为传统药食两用的降脂中药，杨静云等[14]为开发含有他汀类降脂药物的天然中药，将山楂、泽泻和决明子按不同比例配制成固体发酵培养基，以产洛伐他汀的红曲霉进行发酵。用TLC和HPLC对发酵产物的有效成分进行定性和定量分析，结果显示洛伐他汀产量提高124.8%，与未发酵基质相比，中药的有效成分熊果酸、2,3-乙酰泽泻醇-B、大黄酚和大黄素甲醚分别提高了232.7%、173.7%、767.6%和888.4%。可见中药通过微生物的发酵转化后，功效成分的含量得到显著提高，这对于提高中药资源利用率有着不容小觑的价值。

2.2 减轻中药毒副作用

中药中成分复杂，代谢产物多样，因此中药使用中存在的毒副作用与不良反应是限制中药应用范围的重要因素。中药经发酵后，其毒性成分如生物碱类、内酯类、苷类、蛋白质类、重金属等被微生物分解转化，或对有毒成分进行修饰，可达到降低毒性或毒性消失的效果。钩吻又名断肠草，是马钱科植物葫蔓藤的全草，属剧毒之物。具有祛风攻毒、散结消肿、止痛、抗炎、抗肿瘤的功效，但其毒性极大，口服10 g茎叶即可引起中毒，安全性低，时有钩吻中毒的报道，因而大大限制了钩吻的临床应用。钩吻中的生物碱类，如钩吻碱甲、钩吻碱子、钩吻碱己、钩吻绿碱、葫蔓藤碱乙、常绿钩吻碱等是引起中毒的的主要成分，其中以钩吻碱己毒性最强。黄美霞等[15]采用赤芝菌对钩吻进行双向固体发酵炮制后，小鼠急性毒性实验显示，钩吻-赤芝发酵菌质的半数致死量LD50为11.04 g/kg，生品LD50为0.25 g/kg，比生品提高了44倍，表明赤芝菌双向固体发酵是降低钩吻毒性的有效途径。同时还对钩吻-赤芝菌质的药效进行研究，发现菌质比生品有更好的镇痛效果，其小鼠的最大安全给药量由生品0.08 g/kg，上升到6 g/kg，提高了75倍。此外毒性生物碱含量均显著降低，毒性最强的钩吻碱己几乎消失。大黄有抗菌、抗肿瘤的功效，主要是由于所含的蒽醌类物质，其中的结合型蒽醌是引起副反应的主要成分，而游离性蒽醌是其药效成分。传统药方四逆汤具有温中祛寒、回阳救逆的功效，方剂中的附子所含的乌头类生物碱是其有效成分，其中双酯型生物碱有剧毒，因此极大的限制了用药。

2.3 产生新的有效成分

微生物结构简单，但可以产生多种酶系以供维持生命活动，在生长代谢过程中还会产生初级、次级代谢产物。在中药材发酵体系里，有来自微生物的多种代谢物与中药材中的活性成分、非活性成分相遇，发生化学反应，将其分解或产生新的化合物前体，因此也为中药成分的合成和新药开发提供新的方向。枳壳具有行气宽中、消食化痰的功效，中医临床上常用于胸腹满闷胀痛、食积不化、痰饮、胃下垂等的治疗。张栋健等[16]将枳壳饮片加水浸湿，在温度18～30℃，湿度70%～90%条件下自然发酵至长满菌丝，通过UPLC对发酵前后的枳壳饮片进行比较，发现发酵后的枳壳饮片明显产生的两个新的峰，进一步分析确定为是新产生的圣草酚-7-O-葡萄糖苷和橙皮素-7-O-葡萄糖苷两种单糖苷。发酵作用可使圣草苷、橙皮苷这类黄酮类糖苷转化为单糖苷或苷元，使其极性减小、脂溶性增加，快速进入血液循环，起到提高生物利用率的疗效[17]。陆承云等[18]用野生冬虫夏草周围环境中分离的一株曲霉属真菌GL625对金银花进行固体发酵。发酵后的菌质的抑菌活力增强，绿原酸、芦丁含量有所下降，但木犀草苷的含量显著上升，且出现了两种未知物质a、b的含量也显著上升，推测抑菌活力的增强是a、b含量上升所致。李国红等[19]采用枯草芽孢杆菌对三七进行发酵后，对发酵后的皂苷成分检测，发现了生品中从未检测到的人参皂苷Rh4，表明这种新的成分是通过发酵转化而来。

2.4 提高中药资源利用率

中药发酵后除了能达到减毒增效的效果外，利用中药渣作为培养基质，既解决了微生物生长的营养需求，又能产生新的性味功能，还能防止中药残渣可能造成的环境污染，降低生产成本的同时提高中药资源的利用率，一举多得。李秀颖等[20]将提取完皂苷后的黄姜药渣、沸石粉、豆饼、过硫酸钙等制成的固体培养基为原料，通过添加巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、圆褐固氮菌等多种益生菌进行发酵，得到的生物有机肥料不仅生产成本低，还变废为宝减少了药渣对环境的污染。福建中医学院的测定表明，黄芪发酵后所含的黄芪多糖是煎、煮、熬水提法的0.365～5.04倍之间。卫生部药品检验所动物试验的结果表明，发酵中药只需1/28煎、煮、熬水提物的量即可达到与之相当的药效[21]。因此，利用中药发酵方法不仅使药渣变废为宝，产物还可转化为新的资源。

3 中药发酵技术关键

目前中药发酵技术还出在理论和方法上的起步阶段，就目前所报道的中药发酵技术的优点有目共睹，同时也面临诸多问题，如中药成分复杂性、发酵机理不明确、微生物代谢类型多样性都影响的中药发酵技术的发展。掌握正确有效的关键技术，把握中药发酵的方向，仍存在问题有待研究。

3.1 中药发酵机理不明

微生物发酵中药的机理是什么？目前只有基础的推断，更多的是中药化学成分的复杂性，有效成分、非有效成分及其他的特殊基质与微生物的相互作用机制尚不明确，会产生或者会降解中药成分中的哪些物质，仍须进一步探究。

3.2 优良发酵菌种的选择

发酵菌种是中药材发酵的基础和关键，微生物种类繁杂，仅益生菌产生的酶系也各有不同，因此，各种微生物可代谢利用的物质不尽相同。如何才能为不同的中药品种选择合适的的发酵菌种，使发酵后的有效成分含量提高、毒性成分降解、产生新的有效成分，促进药物有效成分吸收，药物利用率实现最大化，还需要大量的研究数据来建立。

3.3 中药发酵模型的筛选和建立

细菌、真菌通过自身产生的果胶酶、纤维素酶等，将中药植物的细胞壁分解，使其中有效成分释放，是目前认为发酵提高药效成分的主要方式。但是不同发酵菌和中药材的组合发酵是如何选择的？通过对各类发酵菌、发酵产物及特性的研究，以及对中药有效成分的探寻最终可以达成针对不同中药材选择不同发酵菌的方式，这样可以大幅减少开发成本，不失为中药开发的新途径。既解决了中药发酵中菌种不纯、针对性不强等缺点，同时也能根据需要将各种微生物组合接种在一起，从而扩大微生物的应用。

3.4 发酵技术及设备的研究

自古以来，就有用发酵炮制中药的传统,但药物的发酵水平多依靠炮制人的经验，无确定的指导方法，也无产品质量标准，因此传统的发酵不能实现有效发展。建立可行的发酵技术，对单味中药、复方中药的发酵提供可行的试验方法，为发酵后有效成分的分离、鉴定和相关的药理实验提供指导，是实现发酵中药现代化、科学化、国际化的前提。发酵设备也是中药发酵中的重要环节，想要实现发酵产物的批量化稳定生产，就要在发酵的每一环节做到量化，实时定量发酵产物中的标志性成分含量，提高可控性和安全性，保证高标准发酵产物的产出。

4 结语与展望

近年来，中医药在疾病的预防和治疗方面越来越受到国际医疗市场的认可，传统药物和天然药物开发的创新药和相关健康产品成为世界药品需求的新趋势。我国纵使拥有极为丰富的中药资源，但不少传统药用动植物的开采量与自然生长量不协调，已经面临濒危，濒危物种逐年增加。因此,珍稀中药品种的保护是一方面，增加药物资源的利用率才是更为长久的解决之道。现如今生物技术手段发展迅速，对于中药材的成分指标、生长指标都能做到不同程度的量化，生产的产品稳定性高，在药材炮制方法中寻求一种能批量化生产、稳定性高、对药材利用率高的方法，现代中药发酵技术应运而生。

发酵能影响到中药活性成分、药理药效等，可以较大幅度地改变药性、提高疗效、降低毒副作用、发现新的药用资源，为中药的发展开辟新的研究领域，是现代发酵技术与中药研究的有机结合，随着中药在临床应用范围的不断扩大，中药开发的产业不断发展，中药发酵在未来中药研究中将拥有越来越重要的地位。