两种复合诱变方法选育掷孢酵母高产油脂菌株

刘 欣，朱健树，刘杨洋，黄玉芸，李子洋，许滋杨，韩玉成(.长春工业大学 化学工程学院，长春 3002；2.吉林省石化资源与生物质综合利用工程实验室，长春 3002)

近年来，能源危机和环境污染已成为全人类面临的重大课题，其中石油供需矛盾尤为突出，研究新的可替代能源迫在眉睫[1]。生物柴油是新能源的一种，燃烧性能好，含硫量低，可代替化石燃料，且环保可再生[2]。目前生产生物柴油的主要原料为动植物油脂等可再生资源，但利用动植物油脂为原料成本高，其成本占到总生产成本的70%～85%，且受场地、季节、气候的影响较大，经济可行性差，制约了生物柴油的产业化进程。

微生物油脂又称单细胞油脂[3]，是指由酵母、霉菌、细菌和藻类等微生物在一定条件下，利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂作为碳源，在菌体内产生的大量油脂[4]。微生物油脂具有发酵周期短，来源比较广泛，不受季节、场地、环境变化影响等优点，是生物柴油产业和生物经济的重要研究方向。其中酵母菌在油脂发酵过程中能积累较大的生物量，且原料来源广泛，受到科研工作者的极大关注。掷孢酵母(Sporobolomycesreseus)是传统的油脂生产菌，其质量的优劣对工业发酵至关重要。诱变是改良菌种的基本方法，但单独使用一种诱变方法，诱变效率低，且易发生回复突变，因而通常采用物理化学复合诱变的方法改良菌种。目前，在其他酵母体系中采用的有效复合诱变方法是紫外(UV)与亚硝基胍(NTG)复合诱变和紫外(UV)与硫酸二乙酯(DES)复合诱变[5-6]。基于此，本研究采用以上两种复合诱变方式对原始菌株掷孢酵母As.2.618进行诱变育种，以筛选高产油脂突变株，进一步提高油脂产量及低温流动性。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种

掷孢酵母(Sporobolomycesreseus)As.2.618，购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心。

1.1.2 试剂

葡萄糖，酵母浸膏粉，琼脂粉，蛋白胨，MgSO4·7H2O，KH2PO4，(NH4)2SO4，无水乙醇，氯化钠，正己烷，石油醚，甲醇，二甲基亚砜，DES，NTG，浅蓝菌素(Cerulenin)，马来酰肼。

浅蓝菌素母液(2.24×10-3mol/L)：5 mg浅蓝菌素充分溶解于10 mL二甲基亚砜中。母液经过0.22 μm的滤膜过滤除菌备用。

2% DES溶液：取0.4 mL DES用少量乙醇溶解，再加2 mol/L pH 7.2的磷酸缓冲液，定容至20 mL。

1.1.3 培养基

斜面培养基：14%麦芽汁斜面培养基，pH 6.0～6.5，121℃灭菌30 min。

种子培养基：葡萄糖40 g/L，酵母膏0.5 g/L，MgSO4·7H2O 5 g/L，KH2PO41 g/L，(NH4)2SO45 g/L，pH 6.0～6.5，121℃灭菌30 min。

发酵产脂培养基：葡萄糖103 g/L，酵母膏11.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.15 g/L，KH2PO40.1 g/L，pH 6.0～6.5，121℃灭菌30 min。

普通平板培养基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，葡萄糖10 g/L，琼脂20 g/L，pH 6.0～6.5 g/L，121℃灭菌30 min。

浅蓝菌素筛选平板培养基：普通平板培养基(1 L)灭菌后降温至50℃，分别向其中加入20、40、60、80、100、120、140、160 μL的浅蓝菌素母液制成筛选平板培养基后倒平板。

马来酰肼筛选平板培养基：向普通平板培养基中添加不同质量浓度的马来酰肼至终质量浓度分别为1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2 g/L。超声溶解，灭菌后倒平板。

1.1.4 仪器与设备

超净工作台，紫外分光光度计，恒温培养箱，恒温水浴锅，高压蒸汽锅，离心机，显微镜，电子分析天平。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种活化与发酵培养

菌种活化：将掷孢酵母As.2.618接于斜面培养基上26℃培养96 h。

种子扩大培养：将在斜面培养基上活化后的菌种接1环到液体种子培养液中，250 mL三角瓶装液量为50 mL，培养条件为26℃，180 r/min，活化48 h。

发酵培养：将培养48 h后的种子液以10%的接种量接于发酵摇瓶进行发酵产脂。向装液量为250 mL 三角瓶中装入50 mL的发酵培养基，培养条件为温度26℃，转速180 r/min，培养120 h。

1.2.2 菌种选育

1.2.2.1 UV-NTG复合诱变及马来酰肼筛选

紫外诱变：取对数生长期的菌体用无菌水配制成108个/mL菌悬液，置于功率15 W的紫外灯20 cm 处，磁力搅拌。紫外照射时间分别为10、20、30、40、50 s，以不同照射时间获得不同诱变剂量[7]。诱变完毕后，在红光下分别取0.10 mL的菌液进行平板涂布，26℃避光培养48 h后以未诱变菌液为对照，计算并绘制致死率曲线。选取致死率为70%～80%的紫外照射时间为最佳紫外诱变剂量。致死率=(对照组菌落数-诱变后菌落数)/对照组菌落数×100%。

NTG诱变：将经紫外诱变选育的突变株进行活化，用无菌水稀释至108个/mL。以不同质量浓度NTG获得不同诱变剂量[8]，向菌悬液中添加NTG至终质量浓度分别为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g/L。振荡处理30 min后，将其涂布于普通平板培养基，26℃恒温培养48 h，以未经诱变处理的菌液平板菌落作对照，计算致死率并绘制NTG致死率曲线。选取致死率为70%～80%的NTG终质量浓度作为最佳诱变剂量。

马来酰肼初筛：经UV-NTG复合诱变后，挑取菌落较大且菌落形态与原始菌株的菌落形态有明显不同的突变株活化，配制成108个/mL的菌悬液，分别取0.10 mL菌液涂布于1.1.3所示的不同终质量浓度的马来酰肼筛选平板中，以未添加抑制剂的平板作对照，26℃恒温培养48 h，计算存活率[9]并绘制马来酰肼存活率曲线。存活率=诱变后菌落数/对照组菌落数×100%。

1.2.2.2 UV-DES复合诱变及浅蓝菌素筛选

紫外诱变：采用1.2.2.1中所述最佳紫外诱变条件对原始菌株进行诱变，选育长势较好的突变株。

DES诱变：将上述突变株活化后稀释至108个/mL，分别取50 mL菌悬液，加入1.2 mL 2%DES溶液，以不同的DES处理时间获得不同诱变剂量，振荡处理40、60、80、100、120 min后[5]，加入10 mL质量分数为25%硫代硫酸钠溶液终止反应。取0.10 mL诱变后菌液均匀涂布于普通平板培养基，26℃恒温培养48 h后，计算并绘制DES致死率曲线。选取致死率为70%～80%的DES振荡时间作为最佳诱变剂量。

浅蓝菌素初筛：将UV-DES复合诱变选育出的突变株于浅蓝菌素筛选平板上筛选，方法同1.2.2.1中马来酰肼初筛。

1.2.2.3 突变株复筛及遗传稳定性实验

复筛：分别从两种初筛平板中各挑选5株长势较好的突变株，移至摇瓶进行发酵，通过生物量、油脂含量、油脂产量3个指标判断菌株的诱变效果。

传代：将上述油脂产量最高的突变株连续5次传代培养后测定其生物量、油脂含量、油脂产量，并比较前后数值的变化。

1.2.3 分析方法

1.2.3.1 生物量的测定

发酵液于7 000 r/min下离心5 min后，倾去上清液，沉淀(菌体)用蒸馏水离心清洗2次，转入已经称量好的称量皿中，于90～100℃烘至恒重(含水量在4%以下)。生物量=干菌体质量/发酵液体积。

1.2.3.2 油脂的提取测定

采用酸热法提取油脂[10]。

油脂产量=油脂质量/发酵液体积

油脂含量=油脂产量/生物量×100%

1.2.3.3 油脂脂肪酸分析

参照文献[11]对油脂进行甲酯化，采用气相色谱进行脂肪酸组分分析。气相色谱条件：GC6890N气相色谱仪，DB-23色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，FID检测器，温度250℃；载气为氮气，流速40 mL/min，氢气流速40 mL/min，空气流速350 mL/min；进样模式为分流进样，分流比30∶1；进样口温度250℃；进样量1.0 μL；程序升温为初温120℃，保持2 min，以4℃/min升温至200℃，保持22 min。

2 结果与分析

2.1 UV-NTG复合诱变及马来酰肼筛选

2.1.1 紫外诱变剂量的确定

按1.2.2.1采用不同的紫外照射时间对原始菌株进行处理，以未经照射的菌株作为对照，通过平板活菌计数法计数照射后的活细胞含量，计算致死率。以紫外照射时间为横坐标，致死率为纵坐标绘制致死率曲线，结果见图1。

图1 紫外照射时间对致死率的影响

由图1可知，紫外照射时间对菌株致死率影响较大。在开始的20 s内，随着紫外照射时间的延长，致死率显著提升，此时致死率为69.48%；但 40 s 后致死率变化减缓，照射40 s和50 s时，致死率分别为84.08%和86.47%。较高的诱变指标(致死率)有利于筛选优良菌株，但如果紫外照射时间过长，则不利于筛选。因此，选择70%～80%为目的致死率作为诱变剂量[12]。选择紫外照射30 s为原始菌株的紫外诱变剂量，此条件下致死率为76.48%。

2.1.2 NTG诱变剂量的确定

NTG是有效的化学诱变剂，可以使DNA分子上的碱基及磷酸部分烷化，导致DNA复制时碱基配对错误而引起突变[13]。菌株菌悬液经不同终质量浓度的NTG诱变后致死率见图2。

图2 NTG终质量浓度对致死率的影响

由图2可知，随着NTG终质量浓度的增加，致死率逐渐升高。选取致死率70%～80%作为最佳诱变剂量，当NTG终质量浓度为0.08 g/L时，致死率为78.43%，在目标致死范围之内。继续提高NTG终质量浓度，菌体致死率迅速提高，当NTG终质量浓度达到0.10 g/L时，致死率为92.16%，菌体接近死亡。因此，选取0.08 g/L为NTG最佳诱变剂量。

2.1.3 马来酰肼筛选

生物柴油中的油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸是经一系列脂肪酸脱氢酶脱饱和而产生的，其活性受到马来酰肼的抑制，使其不能合成正常生理活动所必需的脂肪酸，从而抑制菌株的生长[14]。经马来酰肼筛选后菌落存活率曲线见图3。

图3 马来酰肼处理下掷孢酵母的菌落存活率

由图3可知，随着马来酰肼终质量浓度的提高，原始菌株存活率逐渐下降。当马来酰肼终质量浓度达到2.2 g/L时，菌落存活率仅为12.50%，因此选择2.2 g/L的马来酰肼作为筛选剂加入平板培养中，初步淘汰脂肪酸脱氢酶酶活较低、不足以维持菌株正常生长的突变株。

2.1.4 突变株复筛结果

从马来酰肼初筛平板中挑选5株长势较好的菌落进行复筛测定生物量、油脂含量及油脂产量，5株菌株分别命名为UV-NTG-1，UV-NTG-2，UV-NTG-3，UV-NTG-4，UV-NTG-5，结果见表1。

由表1可知，UV-NTG-2号菌株的生物量、油脂含量及油脂产量最大，分别为39.01 g/L、19.83%、7.74 g/L，较原始菌株分别提高了42.42%、52.30%、116.81%，因此选取该菌株作为UV-NTG复合诱变的最佳菌株，进行传代培养，确定其遗传稳定性。

表1 UV-NTG复合诱变突变株发酵结果

2.2 UV-DES复合诱变及浅蓝菌素筛选

2.2.1 DES振荡时间的确定

DES能使DNA烷基化，从而引起DNA复制时的转换或颠倒而使物种突变或死亡。不同生物对DES的敏感程度不同，因此复合诱变前需确定菌株的最佳诱变条件[15]。DES振荡时间对菌体致死率的影响结果见图4。

图4 DES振荡时间对致死率的影响

由图4可知，延长DES的振荡时间会增加菌体DNA突变的概率，从而提高致死率。当DES振荡时间为100 min时，致死率为70.14%，在目标致死范围内。诱变时间为120 min时，致死率高达93.73%，菌体接近死亡。因此，DES振荡时间选择100 min。

2.2.2 浅蓝菌素筛选

β-酮酯酰-ACP合酶是脂肪酸合成的关键酶，可被天然产物浅蓝菌素进行不可逆抑制，与其活化位点的半胱氨酸上的巯基发生共价结合，形成内酰胺环而使之失活，从而抑制细胞的生长代谢[16-17]。因此，在含有一定浓度的浅蓝菌素培养基上，只有脂肪酸合成酶活性较高的菌株才能存活下来而被选出。经1.2.2.2实验结果确定，在浅蓝菌素的作用下，仅有部分平板有少量菌落存活下来，且大小不一。经浅蓝菌素筛选菌落存活率曲线见图5。

由图5可知，菌落的形成随浅蓝菌素添加量的增加而逐步减少，当浅蓝菌素的添加量达到160 μL(17.92 μmol/L)时，掷孢酵母的菌落存活率为 9.80%，故以此添加量作为筛选处理的最佳剂量。

图5 浅蓝菌素处理下掷孢酵母的菌落存活率

2.2.3 UV-DES复合诱变及浅蓝菌素筛选

从2.2.2浅蓝菌素筛选平板中挑选其中5株长势较好的菌落进行复筛，测定编号为UV-DES-1，UV-DES-2，UV-DES-3，UV-DES-4，UV-DES-5突变株的生物量、油脂含量及油脂产量，结果见表2。

表2 UV-DES复合诱变突变株发酵结果

由表2可知，UV-DES-2号菌株的生物量、油脂含量及油脂产量最大，分别为38.96 g/L、20.80%、8.10 g/L，较原始菌株分别提高了42.24%、59.75%、126.89%。因此，选择UV-DES-2号菌株连续传代培养，考察突变株的遗传稳定性。从结果上看，两种复合诱变方法都能使菌株的产油能力显著提高，可以使油脂产量提高1倍以上，但UV-DES复合诱变方法略优于UV-NTG复合诱变方法。

2.3 油脂脂肪酸分析(见表3)

表3 油脂脂肪酸组成 %

由表3可知，突变株UV-DES-2与UV-NTG-2的脂肪酸组成中，C18∶1的相对含量最高，分别为80.54%和75.35%，分别较原始菌株提高了11.88 个百分点和6.69个百分点；虽然C18∶2含量分别较原始菌株降低了6.45个百分点和2.04个百分点，但十八碳不饱和脂肪酸的总量均较原始菌株有所提高(提高了5.43个百分点和4.65个百分点)；而C20∶1的相对含量均较原始菌株有所下降。在制备生物柴油时，油脂脂肪酸组成中饱和脂肪酸甲酯含量越高且长链脂肪酸甲酯含量越多，该生物柴油的低温流动性越差，因此突变株油脂的流动性较原始菌株高。

2.4 突变株的遗传稳定性(见表4)

表4 传代后菌株的发酵结果

由表4可知，突变株UV-DES-2与UV-NTG-2连续传至第5代的生物量与产油能力分别较第1代无显著差异，说明两种诱变菌株具有遗传稳定性。

3 结 论

采用UV-NTG和UV-DES两种诱变方法对掷孢酵母As.2.618进行诱变，得出在UV-NTG复合诱变及马来酰肼筛选方法中，紫外最佳诱变剂量为30 s，NTG诱变剂量为0.08 g/L，马来酰肼终质量浓度为2.2 g/L，此条件下获得突变株UV-NTG-2的生物量、油脂含量、油脂产量分别为39.01 g/L、19.83%、7.74 g/L，较原始菌株分别提高了42.42%、52.30%、116.81%；在UV-DES复合诱变及浅蓝菌素筛选中，紫外最佳诱变剂量为30 s，DES振荡时间为100 min，浅蓝菌素浓度为17.92 μmol/L，在此条件下获得的突变株UV-DES-2的生物量、油脂含量、油脂产量分别为38.96 g/L、20.80%、8.10 g/L，较原始菌株分别提高了42.24%、59.75%、126.89%。连续传代后油脂产量稳定，油脂的低温流动性较原始菌株有所提高，具有遗传稳定性。菌株UV-DES-2产油能力较强，生长性能良好，是一株具有开发前景的优良高产油脂菌株，以此菌株为基础进一步提高油脂含量将是后续研究中需解决的关键问题。

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