miR-29b在博莱霉素致肺纤维化大鼠肺组织中表达的研究

王亮 杨东霞 杨成（通讯作者）

（滨州医学院 山东 烟台 264003）

1.材料和方法

健康清洁级雄性Wistar大鼠27只，在标准条件下饲养。根据随机分组原则把27只大鼠分为正常对照组(C组，9只)、生理盐水组(N组，9只)和博莱霉素致肺纤维化组(B组，9只)。气管给药，B组按照5mg/kg体重的量注入博莱霉素，N组换成等量生理盐水，注入后立即直立旋转动物，使药液在两侧肺内分布均匀，缝合颈部皮肤切口。每组动物于7、14、28d用腹主动脉放血法分别处死3只。麻醉后处死，气道灌注进行左肺内固定半个小时，行10%福尔马林固定。行切取组织过程，经H-E和Massom染色切片观察病理变化。肺泡炎、肺纤维化程度根据Szapiel[1]等的方法分级。行miR-29b的qRT-PCR检测：（1）各组肺组织总RNA提取。（2）逆转录反应：准备PCR反应体系25µl，取5µl总RNA。（3）各组取5µl行PCR扩增，U6 RNA做内参。从PCR仪读取Ct值后，各样本重复检测3次，取Ct均值，以C组与U6的差作为△Ct；△△Ct表示B组减去△Ct均值的差。做统计分析，以2-△△Ct计算表达量。

数据应用SPSS for windows 13.0统计分析软件在计算机上进行，进行单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2.结果

肉眼观察C组双肺呈淡粉色，表面光滑，弹性良好。B组双肺体积缩小，颜色暗红，表面凹凸不平不平，可见小片状的苍白灶，质地较硬，弹性差。HE染色镜下观察：N组大鼠肺组织无明显病理变化发生(图1A)。B组7d出现中度至中度肺泡炎的改变，肺泡间隔明显增宽，肺泡腔内炎症细胞包括中性粒细胞、巨噬细胞及淋巴细胞浸润明显增多，成纤维细胞开始增生；14-28d肺组织炎症反应逐渐减轻，成纤维细胞增生越来越严重，纤维组织明显增生，肺实质结构破坏萎缩，肺泡腔消失。博莱霉素致肺纤维化模型建立成功。(图1B)。

图1A C组大鼠肺组织 HE染色×200

图1B B组大鼠肺组织（14～28d） HE染色 ×200

B组的肺泡炎评分比C组与N组高，差别有统计学意义(P＜0.05)。具体结果见表1。

表1 各组肺组织肺泡炎评分（±s）

表1 各组肺组织肺泡炎评分（±s）

注：*与C组相比，P＜0.05；#与N组相比，P＜0.05。

组别 第7天 第14天 第28天C组 0.1±0.5 0 0 N组 0 0 0 BLM 组 2.2±0.6*# 1.6±0.4*# 1.4±0.7*#

masson镜下观察N组大鼠肺组织无纤维化改变发生(图2)。B组7d成纤维细胞开始增生，14～28d，逐渐增多，28d肺实质结构完全破坏，大量纤维组织增生。(图3)

图2 C组大鼠肺组织 MASSON染色 ×200

图3 B组大鼠肺组织 MASSON染色 ×200

N组与C组均比B组的评分低，差异有显著性意义(P＜0.05)。具体结果见表2。

表2 各组肺组织纤维化评分（±s）

表2 各组肺组织纤维化评分（±s）

注：*与C组相比，P＜0.05；#与N组相比，P＜0.05。

组别 第7天 第14天 第28天C组 0 0 0 N组 0. 0 0 B 组 0.4±0.5*# 1.4±0.6*# 2.1±0.5*#

各组不同时间点肺组织miR-29b的表达

3.讨论

miR-29b是miR-29中主要成员，近年来miR-29b成为诊疗纤维化疾病的研究热点。目前，已有人通过研究证实，在肝胶原合成增加过程中有miRNA-29b的参与并且表现负性表达，病程的发展速度在miR-29b的作用下呈现下降趋势，这些现象都能够证明miR-29b在对抗纤维化的过程中有着重要的作用[2]。

本实验表明，B组7d后病理学观察大鼠的肺组织呈急性炎症改变，无明显纤维增生改变；B组14d和28d后镜下观察大鼠的肺组织与C组相比均发生纤维组织增生改变。镜下观察细支气管及以下管道的大量胶原纤维化出现、肺泡间隔增宽，炎症逐渐减轻，肺泡逐渐萎缩，泡腔内发生淋巴细胞浸润，尤以近胸膜处病变较为严重。28d较其他组肺纤维化明显加重，说明随着时间的延长，博莱霉素致肺纤维化的作用越明显。利用qRT-PCR检测miR-29b，B组肺组织miR-29b表达在第14及28d均比C组、N组降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。说明随着纤维化病变程度加重，miRNA-29b表达降低。miRNA-29b表达在形成纤维化的病程中的变化，其详细的作用机理还没被完全阐述，推测miR-29b的变化方式可能与肺纤维化初期组织损伤后修复有关联。

综上，本实验提示肺纤维化模型中miR-29b参与肺纤维化的发生发展。其有望作为一个新型的防治肺纤维化的指标。

[1]Szapiel SV，Elson NA，Fulmer JD，et al .Bleomycininduced interstitial pulmonary diseases in the nude，athymicmouse[J].AmRev Respir Dis，1979，120(4):893-899.

[2]俞富军，郑建建，高申孟，等.miR-29b抗肝纤维化的机制研究.中国卫生检验杂志[J].2013，2（23）:268-271.