清润方对糖尿病大鼠肝脏SIRT/NF—κB信号通路的影响

邱宗林 王秋虹 孙丰卉 王泽 林兰

[摘要] 目的 研究清潤方对2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠肝脏内沉默调节蛋白（SIRT）/核因子κB（NF-κB）信号通路的影响。 方法 选取90只12周龄的Wistar雄性大鼠作为研究对象，其中15只作为正常组，其余75只采用脂肪乳灌胃30 d和腹腔注射链脲佐菌素（STZ）的方法建立2型糖尿病胰岛素抵抗模型。将造模成功的60只糖尿病大鼠按照随机数字表法随机分成模型组、二甲双胍组[250 mg/（kg·d）]、清润方大剂量组[11.2 g/（kg·d）]、清润方中剂量组[5.6 g/（kg·d）]和清润方小剂量组[2.8 g/（kg·d）]，每组12只。各组均灌胃给药，每天1次，连续8周。酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测各组肝组织中肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素6（IL-6）的含量，qRT-PCR法和Western blot法检测肝组织中SIRT1、NF-κB和葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）的mRNA和蛋白表达水平。 结果 与模型组比较，清润方大剂量组TNF-α水平降低（P < 0.05），清润方大、中剂量组IL-6水平降低（P < 0.05），清润方各剂量组SIRT1的mRNA和蛋白表达水平升高（P < 0.05），清润方大、中剂量组GLUT4的mRNA和蛋白表达水平升高（P < 0.05），清润方大、中剂量组NF-κB的mRNA和蛋白表达水平降低（P < 0.05）。 结论 清润方可能通过促进糖尿病大鼠肝脏中SIRT1的表达，从而下调NF-κB的表达水平来改善胰岛素抵抗。

[关键词] 清润方；2型糖尿病；胰岛素抵抗；沉默调节蛋白/核因子κB信号通路

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）10（a）-0004-05

Effecf of Qingrun Formula on SIRT/NF-κB signal pathway in liver of diabetic rats

QIU Zonglin WANG Qiuhong SUN Fenghui WANG Ze LIN Lan▲

Department of Endocrinology， Guang'anmen Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100053， China

[Abstract] Objective To study the effect of Qingrun Formula on sirtuin （SIRT）/nuclear factor-κB （NF-κB） signal pathway in livers of rats with diabetes mellitus and insulin resistance. Methods Ninety 12-week old Wistar male rats were selected as objects， 15 rats were as normal group， the other 75 rats were induced by intraperitoneal injection of Streptozotocin （STZ） and gavage with fat milk for 30 days. After successful modeling， 60 rats with diabetes were randomly divided into model group， Metformin group [250 mg/（kg·d）]， high dosage of Qingrun Formula group [11.2 g/（kg·d）]， middle dosage of Qingrun Formula group [5.6 g/（kg·d）] and low dosage of Qingrun Formula group [2.8 g/（kg·d）]， with 12 rats in each group. Each group was given medicine by gavage， once a day， lasting for 8 weeks. The levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-6 （IL-6） in liver tissues of each group were tested by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. The mRNA and protein expression levels of SIRT1， NF-κB and glucose transporter 4 （GLUT4） in liver tissues of each group were tested by qRT-PCR and Western blot. Results Compared with model group， the level of TNF-α decreased in high dosage of Qingrun Formula group （P < 0.05）， the level of IL-6 decreased in high and middle dosage of Qingrun Formula groups （P < 0.05）， the mRNA and protein expression levels of SIRT1 increased in each dosage of Qingrun Formula groups （P < 0.05）， the mRNA and protein expression levels of GLUT4 increased in high and middle dosage of Qingrun Formula groups （P < 0.05）， the mRNA and protein expression levels of NF-κB decreased in the high and middle dosage of Qingrun Formula groups （P < 0.05）. Conclusion Qingrun Formula may alleviate the insulin resistance by increasing the expression of SIRT1 and thereby decreasing the expression of NF-κB in the liver of diabetic rats.

[Key words] Qingrun Formula； Type 2 diabetes mellitus； Insulin resistance； Sirtuin/nuclear factor-κB signal pathway

2型糖尿病作为一种慢性多发性非传染性疾病，严重威胁着全世界人们的健康，中国的糖尿病患者数已经跃居全球第一[1]。2型糖尿病是一种涉及全身的复杂的代谢性疾病，众多的基因、分子和蛋白质参与其发生和发展的过程，其发生和发展的机制研究涉及信号通路和能量代谢等基础生命科学问题。因此，从分子角度去探索糖尿病的发病机制意义重大[2]。清润方（由黄柏、酒大黄和知母等组成）是中国中医科学院广安门医院（以下简称“我院”）林兰教授历经40余年临床与科研创立的糖尿病中医三型辨证中阴虚热盛型的适用方，治疗2型糖尿病阴虚热盛患者临床效果显著[3]。动物实验结果提示，清润方在降低糖尿病大鼠血糖和改善胰岛素抵抗方面疗效确切[4]。本研究从SIRT/NF-κB信号通路的角度研究清润方的作用机制。现报道如下：

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 健康清洁级雄性Wistar大鼠90只，体重（180±20）g，12周龄，购自维通利华实验动物科技有限公司。实验动物质量合格证号：1140070030 4744。

1.1.2 实验药物及试剂 清润方颗粒剂由我院颗粒药房配制，由知母、黄柏和酒大黄等组成；盐酸二甲双胍（格华止）购自中美上海施宝贵有限公司（批号：H20023370）；链脲佐菌素（STZ）（批号：B57218）购自美国Sigma公司；白细胞介素6（IL-6）大鼠酶聯免疫吸附试剂盒（批号：30680231）购自联科生物；肿瘤坏死因子α（TNF-α）大鼠酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（批号：238240285）购自联科生物；qPCR试剂盒SYBR FAST qPCR Kit Master Mix（2×）Universal购自美国KAPA Biosystems公司（货号：KK4601）；SIRT-1抗体购自美国Abcam公司（货号：ab110304）；NF-κB p65抗体购自美国Abcam公司（货号：ab16502）；葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）抗体购自美国Abcam公司（货号：ab33780）；β-actin抗体购自美国Abcam公司（货号：TA-09）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型的制备和分组 ①饲养条件：所有动物饲养于我院动物房，饲养温度（20±2）℃，相对湿度40%～60%。实验室自然采光，通风良好，照明昼夜明暗交替周期为12 h。所有大鼠自由摄食、摄水。②脂肪乳的制备：猪油（20%）、丙硫氧嘧啶（1%）、胆固醇（5%）、谷氨酸钠（1%）、蔗糖（5%）、果糖（5%）、食用盐（6%）溶于Tween80（20%）和丙二醇（30%）中。加水定量配制成脂肪乳。③造模方法：随机选15只大鼠饲以基础饲料为正常组，余75只造模。造模前先用基础饲料适应性饲养1周。明暗周期12/12 h，自由摄食、饮水。造模时将Wistar大鼠灌胃脂肪乳10 d，灌胃量为10 mL/（kg·d）。动物禁食不禁水12 h后腹腔注射STZ 40 mg/（kg·d）（STZ溶于0.1 mol/L新鲜配制的枸橼酸钠缓冲液中，pH 4.2），共连续注射2 d，每次腹腔注射STZ后15 min，给大鼠腹腔注射胰岛素0.4 U，2.5 h和5 h后灌胃给予25%葡萄糖10 mL/kg。最后1次注射STZ后72 h监测血糖。空腹血糖≥16.7 mmol/L为糖尿病大鼠。继续灌胃脂肪乳10 mL/（kg·d），共灌胃30 d。④分组方法：将造模成功的60只实验动物按照随机数字表法随机分为模型组，二甲双胍组，清润方小、中、大剂量组，每组12只。

1.2.2 动物处理 模型组给予生理盐水1 mL/（kg·d），二甲双胍组给予二甲双胍250 mg/（kg·d），清润方大、中、小剂量组分别给予清润方颗粒剂11.2、5.6、2.8 g/（kg·d）。每组均灌胃给药，1次/d，均在每天相同时间灌服，连续8周。按照体表面积法换算人-大鼠的药物剂量，清润方大、中、小剂量组分别按成人剂量的14、7、3.5倍给药。

1.2.3 标本采集与处理 实验结束前1 d傍晚开始，每组取10只大鼠禁食不禁水。第2天上午用10%的水合氯醛溶液以腹腔注射麻醉后，腹主动脉取血。取血后，各组大鼠剥离出完整的肝脏组织，迅速摘取肝组织保存于液氮中。

1.2.4 ELISA法检测各组肝组织中TNF-α和IL-6含量 按照ELISA试剂盒说明书进行操作，分别检测各组肝组织样本中TNF-α和IL-6的表达水平，用酶标仪进行双波长检测，测定450 nm最大吸收波长和570 nm或630 nm参考波长下的OD值。校准后的OD值为450 nm的测定值减去570 nm或630 nm的测定值。

1.2.5 qRT-PCR法检测各组肝组织中SIRT1、NF-κB和GLUT4的mRNA表达水平 Trizol法提取各组肝组织样本中的总RNA，紫外分光光度仪测定RNA的含量。参照反转录试剂盒说明完成反转录反应。引物序列：SIRT1上游引物5′-TCTCCCAGATCCTCAAGCCA-3′，下游引物5′-CTGCAACCTGCTCCAAGGTA-3′；NF-κB p65上游引物5′-CAGACACCTTTGCACTTGGC-3′，下游引物5′-CTTGAGTAGGACCCCGAGGA-3′；GLUT4上游引物5′-AGCTGGTGTGGTCAATACCG-3′，下游引物5′-GGGCCAGGACCAATCTCAAA-3′；β-actin上游引物5′-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3′，下游引物5′-CCCATACCCACCATCACACC-3′。参照实时荧光定量PCR试剂盒说明完成荧光定量PCR的扩增。PCR扩增体系20 μL，包括SYBR Master Mix（2×）Universal 10 μL，上游引物1.5 μL，下游引物1.5 μL，cDNA模板3 μL，再加ddH2O至终体积20 μL。在95℃ 10 min后，进行40个循环扩增。每个循环扩增包括95℃ 10 s、59℃ 60 s。溶解曲线设为95℃ 15 s、72℃ 15 s、95℃ 15 s，一个循环。结果以β-actin为内参对照，每个样本重复5次，记录Ct值，取平均值。采用2-△△Ct方法进行数据的相对定量分析。根据Ct值，计算SIRT1、NF-κB和GLUT4基因的相对表达量。

1.2.6 Western blot法检测各组肝组织中SIRT1、GLUT4及NF-κB蛋白表达水平 将提取的肝组织置于缓冲液（RIPA∶PMSF=500∶1）中，于玻璃匀浆器中制成匀浆，冰上孵育，超声处理，离心，提取组织蛋白。将样本定量于20 μL，凝胶电泳90 min，然后转膜90 min。转膜后，用5%的低脂蛋白封闭液封闭1 h，用5%BSA-TBST稀释鼠单克隆抗体SIRT1（1∶1000），4℃水平摇床孵育过夜。次日洗膜，TBST洗3次，每次10 min。用5%BSA-TBST稀释二抗山羊抗鼠IgG（H+L）HRP（1：10 000），室温孵育40 min。洗膜：TBST洗膜3次，每次10 min。ECL滴加到膜的蛋白面，反应3 min，胶片曝光。图片扫描后，使用软件Gel Image system ver. 4.00对图像进行灰度分析。采用β-actin作为内参对照，同样的方法测定NF-κB和GLUT4的蛋白水平。实验重复3次。

1.3 统计学方法

用SPSS 18.0统计学软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，方差不齐时用Dunnett′s-t3检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组肝组织中TNF-α及IL-6含量比较

与正常组比较，模型组大鼠肝组织中TNF-α及IL-6含量均明显升高（P < 0.05）。与模型组比较，清润方大剂量组和二甲双胍组肝组织中TNF-α含量降低（P < 0.05），清润方大、中剂量组和二甲双胍组肝组織中IL-6含量降低（P < 0.05）。见表1。

2.2 各组肝组织中SIRT1、NF-κB及GLUT4的mRNA表达水平比较

与正常组比较，模型组的SIRT1及GLUT4的mRNA表达量降低（P < 0.05），NF-κB的mRNA表达量升高（P < 0.05）。与模型组比较，清润方各剂量组和二甲双胍组SIRT1的mRNA表达量升高（P < 0.05），清润方大、中剂量组和二甲双胍组GLUT4的mRNA表达量升高（P < 0.05），NF-κB的mRNA表达量降低（P < 0.05）。见表2。

2.3 各组肝组织中SIRT1、NF-κB及GLUT4的蛋白表达水平比较

与正常组比较，模型组的SIRT1及GLUT4的蛋白表达量降低（P < 0.05），NF-κB的蛋白表达量升高（P < 0.05）。与模型组比较，清润方各剂量组和二甲双胍组SIRT1的蛋白表达量升高（P < 0.05），清润方大、中剂量组和二甲双胍组GLUT4的蛋白表达量升高（P < 0.05），清润方大、中剂量组NF-κB的蛋白表达量降低（P < 0.05）。见图1及表3。

3 讨论

2型糖尿病是一种炎症反应性疾病，胰岛素抵抗是其发病机制的一个重要部分，炎性反应参与了胰岛素抵抗和胰岛β细胞的损伤[5]。TNF-α和IL-6等多种炎性细胞因子可以降低机体对胰岛素的敏感性[6]。TNF-α是启动炎性反应的关键因子，可以调节细胞的死亡和生存，可以通过TNFR1和TNFR2两个受体信号诱导胰岛β细胞的凋亡[7]。肝脏是人体的重要代谢器官，参与多种物质和能量的代谢，肝脏是炎性反应的靶器官之一，在人体炎性反应中占有重要地位[8]。GLUT4是一种膜蛋白，存在于胰岛素敏感的骨骼肌、心肌和脂肪细胞中，没有胰岛素时主要位于细胞内的囊泡内，当胰岛素与受体结合后，GLUT4转位至细胞外膜和葡萄糖结合将葡萄糖转运至细胞内[9]。IL-6是胰岛素抵抗相关的炎性细胞因子，它可以抑制胰岛素受体的信号传导，影响GLUT4的合成，降低葡萄糖转运功能[10]。肝脏可以产生多种炎性细胞因子，其中TNF-α和胰岛素抵抗关系密切，是NF-κB信号途径的激活剂。目前研究表明，NF-κB信号通路在胰岛素抵抗中发挥重要的作用[11]。本研究中，清润方大剂量组和二甲双胍组大鼠肝脏中TNF-α和IL-6的含量均降低，提示清润方可能是通过减少肝脏的炎性反应从而改善胰岛素抵抗。清润方大、中剂量组和二甲双胍组GLUT4的mRNA和蛋白表达量均升高，提示清润方可能通过降低IL-6的表达水平，从而提高葡萄糖转运功能。

SIRT1是沉默信息调节因子，是SIR家族7种去乙酰化酶中研究最多的一种酶，广泛存在于机体的各种体细胞及生殖细胞中，在肝脏中有很高的表达，对肝脏代谢有重要作用[12]。它通过影响NF-κB等与胰岛素敏感性相关的信号蛋白，调节下游信号分子的表达或活性，调节糖脂代谢，抑制炎性反应，进而对胰岛素敏感性起着重要的调节作用[13]。研究表明，活化的SIRT1可以提高肝脏、骨骼肌和脂肪组织的胰岛素敏感性，并且可以保护胰岛β细胞[14]。研究表明，SIRT1激活能显著改善db/db小鼠的血糖，提高血浆胰岛素浓度，改善胰岛β细胞质量，增加肝细胞β-细胞生长因子和β-萎缩蛋白的表达[15]。在本研究中，与模型组比较，清润方各剂量组和二甲双胍组SIRT1的mRNA和蛋白表达量都升高，提示清润方可能是通过提高SIRT1在肝脏组织中的表达来改善胰岛素抵抗。

NF-κB是一种细胞核转录因子，它调节的靶基因包括免疫相关受体、细胞因子、炎性因子和黏附分子等。作为各种基因的主要调节因子，其可以通过与一些因子结合参与凋亡和炎症的调节[16]。有研究表明，通过NF-κB信号通路可以增加TNF-α和IL-12的表达，促进炎性反应，加重胰岛素抵抗。2型糖尿病患者体内单核细胞NF-κB的表达升高明显[17]。Wang等[18]研究表明，核转运蛋白β1（KPNβ1）将NF-κB p65从细胞质转运到细胞核，可以增加促炎症基因的表达。通过正调节NF-κB信号通路增强HepG2细胞中棕榈酸诱导的炎性反应和胰岛素抵抗。还有研究表明，用丹参酮治疗STZ诱导的大鼠，可以降低血糖水平，升高TNF-α和IL-6的表达，降低NF-κB的表达，从而减轻2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗[19]。SIRT1主要是通过对NF-κB的去乙酰化作用参与炎性反应，SIRT1通过对NF-κB的RelA/p65亚基上第310个赖氨酸去乙酰化作用，抑制NF-κB的活性，进而影响其与DNA的结合，影响TNF-α的基因表达，降低炎性反应[20]。在本研究中，与模型组比较，清润方大、中剂量组NF-κB的蛋白表达量降低，提示可能是清润方提高SIRT1在肝脏组织中的表达后，SIRT1抑制了NF-κB的表达，从而起到了抗炎的作用。

综上所述，清润方作为治疗糖尿病胰岛素抵抗的一种有效中药复方，其可能是通过调控肝脏SIRT1/NF-κB信号通路，促进SIRT1的表达，抑制NF-κB的表达，进一步下调TNF-α等炎性细胞因子的表达，从而改善炎症状态，具体的信号通路及转导机制还需要进一步研究。

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（收稿日期：2018-07-02 本文編辑：张瑜杰）