下调人质膜型唾液酸酶对前列腺癌PC—3细胞增殖、侵袭能力的影响及其机制

李晓洁 姜俊 朱蓓

[摘要] 目的 探討人质膜型唾液酸酶（Neu3）表达降低对前列腺癌PC-3细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响。 方法 构建pGCsi-Neu3质粒，从GeneBank中寻找符合Neu3 mRNA特异的靶序列，合成siRNA模板链后与载体相连接，转入感受态细胞，测序鉴定。应用真核细胞转染技术转染前列腺癌PC-3细胞，利用荧光显微镜检测转染效率；细胞增殖实验检测pGCsi-Neu3质粒对细胞增殖的影响；流式细胞术检测细胞凋亡的改变；Transwell迁移、侵袭实验检测细胞迁移、侵袭能力的变化。 结果 针对Neu3基因设计了siRNA序列并成功构建pGCsi-Neu3质粒，pGCsi-Neu3-3质粒对基因Neu3的抑制最为有效。与对照组比较，pGCsi-Neu3-3质粒可有效抑制肿瘤细胞增殖（P < 0.01）；pGCsi-Neu3-3质粒可引起前列腺癌PC-3细胞凋亡，凋亡率明显高于空白对照组（MOCK组），差异有统计学意义（P < 0.05）；pGCsi-Neu3-3质粒可使前列腺癌PC-3细胞增殖细胞核抗原表达明显下降；pGCsi-Neu3-3质粒可抑制前列腺癌PC-3细胞迁移、侵袭能力，且与对照组比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。结论 针对Neu3基因siRNA表达质粒的构建、鉴定和初始研究，为Neu3对前列腺癌细胞生长、转移发挥作用机制的研究奠定实验基础。

[关键词] 人质膜型唾液酸酶；前列腺癌；质粒构建；增殖；侵袭

[中图分类号] R737.25 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）10（a）-0008-05

Influence of down regulation of Neu3′s to PC-3 cell′s proliferation， invasiveness， and its mechanism

LI Xiaojie JIANG Jun ZHU Bei

Department of Basic and Pharmacy， School of Medicine and Technology， Taizhou Polytechnic College， Jiangsu Province， Taizhou 225300， China

[Abstract] Objective To investigate the influence of Neu3 gene silencing in growth inhibition of PC-3 cell and to elucidate the underlying mechanisms. Methods Three pieces of siRNA sequences on the Neu3 gene were designed and then a recombinant plasmid carrying siRNA was constructed， which was used to transfer PC-3 cells in order to screen the most effective sequence among the three siRNA sequences against Neu3； PC-3 cell transfection pGCsi-Neu3 plasmid， inverted microscope was used to observe the transfection efficiency， determined by MTT test their effects on cell proliferation and flow cytometry was used to detect the change of cell apoptosis； Transwell migration and invasion assay were performed to detect the migration and invasion cells of groups. Results The siRNA sequences targeted to Neu3 gene were designed and their expression vectors were cloned and verified successfully. Compared with control group， pGCsi-Neu3-3 plasmid significantly inhibited cell proliferation （P < 0.01）； pGCsi-Neu3-3 plasmid significantly promoted the apoptosis of PC-3 cells of prostate cancer compared with the blank control group （Mock group）， the difference was statistically significant （P < 0.05）. pGCsi-Neu3-3 plasmid could inhibit the migration and invasion assay of PC-3 cells of prostate cancer， compared with the control group， with statistically significant difference （P < 0.01）. Conclusion Construction， identification and initial study of Neu3， might lay the foundation of experiment for the study of growth and metastasis mechanism of prostate cancer cell.

[Key words] Human plasma membrane-associated sialidase； Prostate cancer； Plasmid construction； Proliferation； Migration

DNA损伤后在修复过程中有时会出现错误，致使基因突变，如癌基因的激活或過表达[1-2]，抑癌基因的失活或抑癌产物的缺失[3-4]，从而细胞生长失控、分化能力减弱形成单克隆、不断增生的细胞团——肿瘤。发病率与年龄密切相关的前列腺癌，在美国位居男性恶性肿瘤的首位。最新统计报告显示，2016年发病人数为180 890人[5]，在中国社会人口老龄化的大背景下其发病率呈现急剧上升的趋势[6]。唾液酸酶可降解糖脂和糖蛋白非还原末端的唾液酸[7-8]，目前根据细胞定位共分为4种亚型——Neu1、Neu2、Neu3、Neu4[9-10]。Neu3主要定位在细胞膜，参与细胞黏附、迁移等生理功能[11-12]。研究发现Neu3在前列腺癌中表达增高[13]。此外在肺癌[14]、结肠癌[15]、黑色素瘤[16]、胶质母细胞瘤[17]等多种肿瘤组织中Neu3表达水平也增高[18]。但目前Neu3表达改变是肿瘤发生的原因还是结果尚不清楚，本研究选取前列腺癌激素非依赖型PC-3细胞作为研究细胞，构建针对Neu3基因的siRNA表达质粒，观察其对PC-3细胞增殖、迁移过程的影响，为前列腺癌靶向治疗探寻新的、潜在的靶点。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

JILSON加样器、SONY低温高速离心机、恒温水浴箱、SANYO CO2恒温培养箱、分光光度计、SONY自动高压蒸气消毒器、YZ-875超净工作台、SONY -80℃低温冰箱。

1.2 主要试剂

IMDM培养液、胎牛血清、Transwell小室（Hyclone公司）；LipofectamineTM2000（Invitrogen公司）。胰蛋白酶（GBICO美国）；噻唑蓝（MTT）细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（Sigma美国）；DL2000 DNA Marker、DL1500 DNA Marker、Taq DNA聚合酶、BamH Ⅰ酶、Hind Ⅲ酶（TAKARA日本）、胶回收试剂盒（TAKARA日本）、Annexin V-FITC/PI试剂盒（Abcom公司）。

1.3 质粒、菌种及细胞系

PC-3细胞购于ATCC，质粒pGCsilencer-U6/Neo/GFP（上海吉凯基因化学有限公司）。菌株JM-109和减毒沙门菌为吉林大学病理生理学实验室所保存。

1.4 细胞培养

PC-3细胞按ATCC培养条件：用含有100 μg/mL青链霉素、10%胎牛血清的IMDM（Hycolone，USA）培养液在37℃含5%CO2孵育箱中，常规培养、传代。

1.5 pGCsi-Neu3重组质粒的构建

1.5.1 Neu3-siRNA模板寡核苷酸的设计 根据Neu3 mRNA特异的靶序列，合成针对其编码区130-149、220-239及839-858位碱基序列的3条DNA寡核苷酸链，分别命名为shRNA-Neu3-1、shRNA-Neu3-2和shRNA-Neu3-3，每条正义链包括5′末端BamH Ⅰ酶切位点和反向的两个一致的靶序列（19 bp）。设计时，shRNA模板中的loop结构选用了TTCAAGAGA以避免形成终止信号，shRNA的转录终止序列采用T6结构[19]。shRNA-Scramble对照：碱基顺序随机排列，与人类基因的外显子没有同源性（实验室提供）。

1.5.2 pGCsilencer-U6/Neo/GFP载体线性化及回收 使用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ两种内切酶将pGCsilencer-U6/Neo/GFP质粒切开，琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，切取含有线性化质粒的凝胶，按照TAKARA胶回收试剂盒的操作流程说明书进行回收，采用λDNA Marker做标准品对线性化质粒定量。

1.5.3 载体与siRNA模板链连接 T4连接酶连接模板与载体，模板与载体按照摩尔数比约为4︰1的比例加入，16℃反应过夜。

1.5.4 重组质粒的鉴定 BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切pGCsilencer-U6-siRNA-Neu3质粒（以下简称“pGCsi-Neu3”）。酶切后产物电泳结果显示有小片段者初步预测可能为阳性重组质粒。怀疑为阳性克隆的重组质粒委托上海生物工程技术服务有限公司进行cDNA序列测定鉴定。

1.5.5 荧光显微镜检测PC-3细胞转染pGCsi-Neu3质粒的转染效率 pGCsi-Neu3质粒携带GFP基因，当质粒转染PC-3细胞后可表达绿色荧光蛋白，为保证后续实验的可靠性，首选需要确定细胞的转染效率不低于50%。转染效率=发绿色荧光的细胞数/可见光下细胞数×100%。该实验重复3次。

1.6 细胞增殖实验

细胞生长融合度达90%时，进行瞬时转染，只加入转染试剂的命名为空白对照组（Mock组），转染pGCsi-Scramble质粒的命名为pGCsi-Scramble组，转染3个不同位点的pGCsi-Neu3质粒的分别命名为pGCsi-Neu3-1组、pGCsi-Neu3-2组、pGCsi-Neu3-3组，后续实验参照此分组命名。用PBS将MTT配置为终浓度为5 mg/mL的工作液，细胞瞬时转染后分别在24、48、72 h检测细胞数目，检测时每孔加入含有10 μL MTT工作液的培养液继续培养4 h后，去除上清，每孔加入100 μL的DMSO，震荡混匀后检测A490吸光度值。该实验重复3次。

1.7流式细胞术

收集转染后48 h的PC-3细胞，预冷PBS洗涤细胞3次后，参照Abcom公司Annexin V-FIFC试剂盒说明书进行实验操作，流式细胞术分析细胞凋亡。该实验重复3次。

1.8 Transwell检测pGCsi-Neu3质粒对细胞迁移、侵袭的影响

Transwell细胞迁移实验[20]按照ECM550系列迁移实验操作说明，将200 μL含有5×104个细胞的IMDM无血清培养基混悬液加入Transwell上室，下室加入600 μL含有10%FBS的培养基，培养24 h后，多聚甲醛固定，結晶紫染色，于倒置显微镜选取3个视野拍照记录，选用浓度为33%醋酸进行结晶紫脱色，洗脱液混匀后在酶标仪上595 nm测其OD值，间接反映细胞数。该实验重复3次。Transwell细胞侵袭实验[20]：上室加入40 μL的1︰7无血清培养基稀释的Matrigel胶，37℃细胞培养箱过夜，于次日进行迁移实验。其固定、染色、拍照、洗脱等实验步骤参照Transwell迁移实验。该实验重复3次。

1.9统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用F检验，两组间比较采用q检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 pGCsi-Neu3质粒构建及测序结果

原始质粒及酶切后电泳结果见图1A，根据不同靶点构建的3个pGCsi-Neu3质粒进行BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切鉴定，均有小片段被切下，见图1B，酶切鉴定成功后，进行DNA测序鉴定，测序结果与连入siRNA模板链序列完全一致，见图1C。

2.2 pGCsi-Neu3质粒转染结果及荧光显微镜检测

PC-3细胞转染质粒48 h后，在蓝色荧光激发下发现转入pGCsi-Neu3-1、pGCsi-Neu3-2、pGCsi-Neu3-3质粒的PC-3细胞发出绿色荧光。转染效率超过70%，可以保证后续实验数据的可信性。见图2（封底）。

2.3 pGCsi-Neu3质粒沉默效率

转染48 h后，Mock组、pGCsi-Scramble组、pGCsi-Neu3-1组、pGCsi-Neu3-2组、pGCsi-Neu3-3组PC-3细胞中Neu3相对表达量分别为：0.752±0.029、0.741±0.019、0.493±0.033、0.427±0.024、0.219±0.023。pGCsi-Neu3-3组PC-3细胞中Neu3相对表达量明显低于对照组（Mock组、pGCsi-Scramble组），差异有统计学意义（P < 0.05）。

2.4 pGCsi-Neu3质粒对PC-3细胞增殖、凋亡的影响

PC-3细胞转染重组质粒后，采用MTT法监测在24、48、72 h等时间点细胞的生长。在48、72 h时，pGCsi-Neu3-1组、pGCsi-Neu3-2组和pGCsi-Neu3-3组与Mock组、pGCsi-Scramble组比较，可有效抑制细胞增殖，差异有统计学意义（P < 0.01），其中pGCsi-Neu3-3组抑制效果最为明显。根据MTT实验结果，收集转染后48 h的各组细胞，PI和Annexin V双重染色后通过流式细胞术检测凋亡发现，pGCsi-Neu3-3组与Mock组比较细胞凋亡明显，凋亡率为18.1%，见图3B。免疫组织化学法检测PCNA的表达，结果发现pGCsi-Neu3-3组与对照组比较，细胞核中少见棕黄色颗粒。见图3A。

2.5 pGCsi-Neu3质粒抑制细胞迁移和侵袭

PC-3细胞转染质粒后，利用Transwell实验检测PC-3细胞转移、侵袭能力的改变。结果发现pGCsi-Neu3-3组，无论是迁移实验还是侵袭实验，其细胞数目与Mock组比较，均有所下降，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图4（封底）。

3 讨论

Neu3是唾液酸酶家族重要的一员，广泛表达于人体各种组织中，参与多种生理活动。Neu3表达增高对肿瘤的发生、发展发挥重要影响。本研究构建针对Neu3基因siRNA表达质粒，并对其进行鉴定和筛选后，在体外检测降低Neu3表达对前列腺癌的生长、转移的作用及机制。

本研究根据Neu3基因信息，使用在线siRNA序列设计软件，设计了3条针对目的基因编码序列区的siRNA序列，测序鉴定质粒构建成功。为保证实验数据的可信性，首先进行了转染效率的测定，结果发现利用脂质体进行转染，PC-3细胞转染效率可以超过70%，可以保证后续实验需求。Neu3 mRNA检测发现3号Neu3 siRNA抑制目的基因效率最高，MTT实验结果显示3号Neu3 siRNA抑制细胞增殖效果最为明显，根据上述两个实验结果因此后续实验均选择3号pGCsi-Neu3-3质粒进行。流式细胞术结果显示pGCsi-Neu3-3质粒促进PC-3细胞凋亡，凋亡率可达18.1%。细胞增殖相关基因（PCNA）在细胞增殖的启动上起重要作用，是反映细胞增殖状态的良好指标[21]。pGCsi-Neu3-3组细胞核棕黄色颗粒明显减少，表明细胞增殖能力明显下降。Transwell实验结果显示pGCsi-Neu3-3组细胞数目减少，说明细胞迁移、侵袭能力下降。降低Neu3表达可抑制细胞增殖、迁移、侵袭，促进细胞凋亡，为今后前列腺癌靶向治疗提供一个新的参考治疗靶点。

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（收稿日期：2018-01-02 本文编辑：任 念）