超高效液相色谱—串联质谱法快速测定大鼠血清中种神经递质

赵芳+李强+梁梅丽+闫艳+邢婕+秦雪梅+高晓霞��

摘要建立了同时测定8种神经递质（5HT、GABA、Glu、ACH、NE、DA、5HIAA和HVA）的超高效液相色谱三重四极杆质谱方法（UHPLCMS/MS），并用于大鼠血清样品的测定。大鼠血清经含01% 甲酸乙腈沉淀蛋白处理后，选用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×21 mm，17 μm），以01% 甲酸乙腈为流动相梯度洗脱进行分离； 采用电喷雾离子源（ESI），在正离子扫描下，采用多反应监测模式（MRM）对8种神经递质及内标化合物进行检测。结果表明，8种神经递质可在10 min内准确测定； 定量限为18 ng/mL，且线性良好，相关系数均大于0994，日内、日间精密度（n=6）≤92 %，稳定性、加标回收率和基质效应等均符合分析要求。本方法分析时间短、准确度好、灵敏度高、专属性强、稳定性好、基质效应小，适用于血清中3类（单胺类、氨基酸类和乙酰胆碱）共8种神经递质的同时定量检测。

关键词超高效液相色谱串联质谱； 神经递质； 血清； 含量测定

1引 言

神经递质是在神经化学传递中充当“信使”的特定化学物质。脑内神经递质分为4 类，即单胺类、氨基酸类、肽类和其它类[1]。随着神经生物学及医学的发展，越来越多的具有神经活性的递质被发现，且参与人类多种疾病，尤其与精神类疾病，如抑郁症、焦虑症、阿尔滋海默病和记忆障碍等密切相关。神经递质种类多，在人体内发挥作用通常并不是由某一类递质含量单独变化引起的。但是，神经递质在生物样品中含量低，且生物样品基质复杂，内源性成分干扰较大，是生物医学分析的难点问题。

目前，测定神经递质方法主要有高效液相色谱联用紫外、电化学、荧光或质谱检测法[2～4]。然而电化学检测因为电极易受污染而重现性不佳[5]； 紫外检测器与荧光检测器对神经递质响应信号弱，均需要柱前或柱后衍生化[6]，处理步骤繁琐，程度难以控制。因此高效简便的前处理方法及高灵敏度的检测手段是研究神经递质在体内浓度变化的关键。质谱检测因其选择性强、灵敏度高、样品前处理步骤简单等优势成为重要的有效检测手段。已有的高效液相色谱质谱测定神经递质及其相关代谢物多应用于脑匀浆或脑微透析液中[7～9]，血清中多侧重于其中某一类神经递质的测定，例如只针对氨基酸类递质的测定[10]或只针对单胺类神经递质的研究[11]。针对以上情况，本研究在《中国药典》（2015年版）生物样品定量分析方法验证指导原则（9012）的指导下，利用UHPLCMS/MS建立了同时对血清中单胺类、氨基酸类和乙酰胆碱共8种神经递质的快速定量方法。本方法前处理简单快速，采用内标法定量，专属性强。实验结果表明，本方法灵敏度高、选择性好、重现性好， 适合批量样本分析。

2实验部分

21仪器和试剂

1290Ⅱ超高效液相色谱仪（美国Agilent公司）； 3200 QTRAP 三重四极杆串联质谱仪（美国AB Sciex公司）； ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱 （100 mm×21 mm， 17 μm， 美国Waters公司）； Neofuge 13R高速冷冻离心机（力康公司）； MXS可调式混匀仪（美国Scilogex公司）。

对照品： 5羟色胺（5HT，批号AWEHLMD，日本TCI有限公司）； γ氨基丁酸（GABA，批号23122，中国阿拉丁公司）； 谷氨酸（Glu，批号B326BA1039）和乙酰胆碱（ACH，批号B326BA2755）均购自生工生物公司； 去甲肾上腺素（NE，批号Z558VXU3，中国食品药品检定研究院）； 多巴胺（DA，批号S05J6G2）、5羟基吲哚乙酸（5HIAA，批号ERMPOBK）和高香草酸（HVA，批号S07J6G1）均购自博飞美科公司； 内标3，4二羟基苯甲酸（DHBA，批号MKBS7646V，美国SigmaAldrich公司）。甲醇、乙腈和甲酸（色谱纯，Thermo Fisher公司）。 实验用水为超纯水（MilliQ纯水机，美国Millipore公司）。

22实验方法

221色谱条件流动相： 01%甲酸（A）和乙腈（B）。梯度洗脱程序： 0～25 min，5% B，25～4 min，5%～20% B； 4～7 min，20%～60% B； 7～75 min，60%～5% B； 75～10 min， 5%B。流速： 02 mL/min。柱温： 30℃。进样量： 3 μL。

222质谱条件电喷雾离子源（ESI）： 正离子模式； 多反应监测模式（MRM）气帘气： 400 psi； 碰撞气体： N2； 喷雾电压： 5500 V； 离子源温度： 500℃； GS1： 50 psi，GS2： 50 psi； 气体流速： 12 L/min。质谱测定母离子、子离子与仪器参数见表1。

223标准溶液和QC溶液的配制（1） 标准品储备液配制分别称取5HT、GABA、Glu、ACH、NE、DA、5HIAA和HVA對照品约50 mg，各加入溶剂（02%甲酸甲醇， 8∶2，V/V）溶解，并分别定容至5 mL，制得标准品储备液。（2）混合标准溶液配制分别精密量取标准储备液适量，置同一容量瓶中，混匀，加溶剂（02%甲酸甲醇，8∶2， V/V）定容，制得浓度分别为90、45、18、09、045、018和009 μg/mL的5HT和NE，450、225、1125、45、225、90和45 μg/mL的GABA，450、225、1125、45、225、090和045 μg/mL的Glu，24、12、048、024、012、0048和0024 μg/mL的DA， 09、045、018、009、0045、0018、0009 μg/mL的5HIAA、ACH和HVA的混合标准系列溶液，4℃保存备用。（3）质量控制（QC）液配制同法稀释配制低、中、高3种不同浓度的溶液，用于配制QC溶液。溶液浓度分别如下： 5HT和NE 72、09和018 μg/mL； GABA 360、45和1125 μg/mL； Glu 36、45和1125 μg/mL； DA 192、024和0048 μg/mL； 5HIAA、ACH和HVA 072、009和0018 μg/mL，4℃保存备用。endprint

224内标溶液的制备称取DHBA对照品约50 mg，加入溶剂（02%甲酸甲醇， 8∶2，V/V）溶解并定容至5 mL，得到浓度约为10 mg/mL内标储备液。精密量取适量内标储备液，加溶剂定容至100 mL，制得浓度为36 μg/mL的DHBA内标标准溶液，4℃保存备用。

225动物分组、血清样品采集与预处理SD大鼠24只，随机平均分为3组（K，CY，CM），每组8只。其中CY组灌胃给予阳性药盐酸文拉法辛（35 mg/kg），其它两组灌胃给予空白溶媒，连续给药21天； CY组和CM组自给药第一天开始参照本课题组前期CUMS造模方法连续造模21天[12]，K组不予造模。在21天实验完成时采用腹主动脉取血的方式采集血液，置于EP管中，静置30 min，4℃下3500 r/min离心10 min，分离血清，于

Symbolm@@ 80℃保存備用。 实验时，大鼠血清样本经室温缓慢解冻。准确量取大鼠血清100 μL， 置15 mL EP管中， 加入内标20 μL， 02%甲酸甲醇（8∶2，V/V）溶液20 μL， 01%（V/V）甲酸乙腈200 μL， 涡旋5 min混匀， 4℃下13000 r/min 离心10 min， 取上清液置于进样小瓶中，待测。

3结果与讨论

31神经递质的选择

神经递质种类多样，与人类多种精神类疾病相关。本研究以抑郁症动物模型为例，测定了单胺类、氨基酸类和乙酰胆碱3类神经递质，考察得出其含量变化与中枢神经系统（CNS）疾病均有密切关系。单胺类神经递主要有5HT、NE、DA等，具有广泛的生物学活性，参与许多CNS的生理反应。神经突触间隙单胺类递质浓度水平减少被认为与抑郁症的发病有关，抑郁症自杀患者脑内5HT与其代谢物5HIAA含量均有所下降[13]。研究表明，神经中枢系统中5HT还与阿尔兹海默病等神经系统疾病有密切的联系[14，15]。神经突触释放5HT减少是导致CNS发病的主要因素之一。NE是主要来自肾上腺髓质的一种神经递质，其分泌受交感神经调节，研究发现， 脑中枢神经系统NE含量不足也会导致抑郁症，反之则发生躁狂症[16]。DA与某些神经系统功能障碍导致的疾病密切相关，如帕金森病和抑郁症等[17，18]。Randrup于1975年首先提出，DA含量降低可能与抑郁症的发病相关[19]，且代谢产物HVA含量也会下降[20]。影响中枢神经系统的氨基酸类神经递质主要为Glu和GABA。Glu是学习和记忆必需的一种兴奋性型神经递质，但在高浓度下可能产生有害影响。研究表明，慢性应激刺激后谷氨酸大量释放，进而产生神经元损害[21]。GABA是脑内主要的抑制性神经递质，可以通过抑制性神经元突触前末梢释放而产生抑制效应。当GABA缺乏时常可诱发癫痫发作，提高GABA的浓度可以起到抗癫痫作用[22]。ACH是多重神经系统学习和记忆过程的重要神经递质，人体缺少ACH则会加速脑细胞的衰老，使记忆力显著下降，甚至导致老年痴呆[23]。压力状态下，脑内乙酰胆碱能神经元功能亢进，导致HPA轴功能亢进，最终还可以导致抑郁症的发生[24]。上述8种神经递质在人身体各组织系统中发挥着广泛的调节作用，其含量变化与人类多种CNS疾病密切相关[25～27]。因此，检测生物样品中这些物质的浓度变化对于CNS相关疾病的诊断及治疗有重要意义。

32色谱条件优化

由于待测物种类比较多且含酸性碱性等不同类型化合物，因此考察了对照品溶剂及其不同酸度，分别用189%甲酸甲醇（7∶3， V/V）和02%甲酸甲醇（8∶2， V/V）溶解对照品并进样，以待测物的分离度、灵敏度及选择性为参考基准，发现前者有待测物出现双峰，而后者待测物出峰均符合要求。

分别考察了乙腈和甲醇的流动相体系，发现乙腈作为流动相时出峰更平滑，峰形更好。考虑到待测物的化学性质，对流动相中碱性（氨水）、酸性（01%甲酸、02%甲酸）及缓冲盐体系（乙酸乙酸铵， pH=35； 10 mmol/L乙酸铵）等添加剂的种类与浓度进行考察，综合比较发现01%甲酸分析效果最佳。最终确定01%（V/V）甲酸为流动相A、乙腈为流动相B，优化后的梯度条件为： 0～25 min， 5% B； 25～40 min， 5%～20% B； 4～7 min， 20%～60% B； 7～75 min， 60%～5% B； 75～10 min， 5%B。 图1为空白血清和血清中加入低浓度标准的8种神经递质的色谱图。

33血清样本预处理方法的优化

本研究中测定的化合物极性较大，因此重点考察不同溶剂沉淀蛋白的效果。对沉淀蛋白的有机试剂甲醇和乙腈进行考察，结果显示经乙腈沉淀蛋白后待测物的峰形更平滑，背景基质干扰更小。实验中还发现在乙腈中加入甲酸可以改善目标化合物的峰形，且01%甲酸乙腈（V/V）为最佳。推测可能由于待测化合物的化学结构均含酸性或碱性基团的原因。

34方法学考察

由于待测化合物属于大鼠血清样本中内源性物质，为了降低基质效应对测定结果的影响，本研究依据《中国药典2015年版生物样品定量分析方法验证指导原则（9012）》，采用血清基质添加标准品的方法进行方法学验证，考察了标准曲线与线性范围、精密度与准确度、提取回收与基质效应和稳定性。

341标准曲线及线性范围取离心机管数支，分别加入已知浓度的大鼠血清100 μL、20 μL的内标溶液（36 μg/mL）和20 μL的标准系列液，涡旋混匀。按照“血清样品预处理”项下方法操作。以待测物峰面积（As）与内标物峰面积（Ai）的比值与空白血清样品中待测物峰面积（A0）与内标物峰面积（A0i）比值的差值为纵坐标（y=As/Ai–A0/A0i）、以血清中加入的待测物标准品浓度（μg/mL）为横坐标（x），用加权最小二乘法进行回归计算，权重系数为 1/x2，得到8种神经递质的回归曲线方程。 LOQ是标准曲线上最低浓度点，信噪比（S/N）>10。结果见表2。endprint

342准确度和精密度取空白血清100 μL，分别加入20 μL内标溶液和20 μL高、中、低3个浓度的QC溶液，配制成高、中、低3个浓度水平的样品，按照225方法进行预处理。每个浓度进行6个样本分析，并且连续进样3天，根据当天的标准曲线计算高、中、低3个浓度水平样品的浓度，求算本方法的精密度RSD（%）和准确度RE（%），结果见表3。

343基质效应与提取回收率取空白血清100 μL，分别加入20 μL内标和20 μL高、中、低3个浓度的QC溶液，按照225节预处理，测得的待测物峰面积为A1； 另取空白大鼠血清100 μL，先按照225节预处理，加入20 μL内标和20 μL高、中、低3个浓度的QC溶液，混匀测得的待测物峰面积为A2； 取空白溶剂100 μL，分别加入20 μL内标和20 μL高、中、低3个浓度的QC溶液，按照225节预处理，测得的待测物峰面积为A3，每个浓度样品分别平行制备3份。提取回收率= A1/A2×100%； 基质效应= A2/A3×100%。结果见表3。

35样品分析

采用本方法对SD大鼠血清进行测定，结果如表5所示，与空白对照组相比，模型组5HT和NE含量显著降低，GABA和5HIAA的含量显著升高，与文献[11，28～30]报道的研究结果一致。Glu、DA、Ach和HVA虽也具有升高趋势（3%～10%），但未显示显著差异。经文拉法辛给药后，5HT、GABA和5HIAA显著回调； NE和Glu有回调趋势，与文拉法辛的抗5HT与NE的再摄取抑制作用机制一致。

4结 论

本研究建立了同时对大鼠血清中单胺类、氨基酸类和乙酰胆碱共8种神经递质的UPLCMS/MS快速定量分析方法，优化了血清样品制备方法，减少了前处理步骤繁琐带来的较多误差，分析更加快速简便。 本方法线性关系较好、灵敏度高、稳定性好，提取回收率与基质效应均符合相关要求。本方法不仅可用于抑郁症血清样品中神经递质水平的测定，而且可用于CNS相关疾病样品的测定与诊断。

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AbstractAn ultrahigh performance liquid chromatography tandem mass spectrometric （LCMS/MS） method for simultaneous determination of 8 kinds of neurotransmitters （5HT， GABA， Glu， ACH， NE， DA， 5HIAA， HVA） in rat serum was developed The blood samples were extracted by 01% formic acid in acetonitrile and separated on a Waters ACQUITY UPLC BEH C18 （21 mm×100 mm， 17 μm） using gradient elution， with the mobile phase consisting of acetonitrile and 01% formic acid in water The samples were then ionized with positive electrospray （ESI+）， and detected under multiple reaction monitoring （MRM） mode As a result， 8 kinds of neurotransmitters were determined accurately in 10 min with a limit of quantitation of 18 ng/mL and intraday and interday precisions of ≤92% （n=6） This method showed a good linearity in detection of neurotransmitters and the linear correlation coefficients were greater than 0994 Also the stability， recovery and matrix effect were eligible for the analysis This method showed high accuracy， sensitivity， strong specificity， good stability， small matrix effect and short time for analysis， and was suitable for the quantitative determination of monoamine， amino acids and acetylcholine neurotransmittes in rat serum

KeywordsUltrahigh performance liquid chromatographtandem mass spectrometry； Neurotransmitters； Serum； Determinationendprint