青稞新光合作用相关基因的克隆和序列分析

巴桑玉珍，扎 桑，王玉林，徐齐君，原红军，尼玛扎西

（1.西藏自治区农牧科学院农业研究所，西藏拉萨850002；2.省部共建青稞和牦牛种质资源与遗传改良国家重点实验室，西藏拉萨850002；3.西藏自治区农牧科学院，西藏拉萨850002）

青稞（Hordeum vulgareL.var.nudumHook.f.）属禾本科大麦属，是栽培大麦的变种，成熟时籽粒内外稃与颖果分离，籽粒裸露，也称裸大麦。青稞是高原特色农作物之一，有独特的营养结构和保健作用，具有显著的利用价值，为藏族人民主要粮食作物，其产量高低直接关系到藏区人民的经济和生活[1]。青稞主要生长在海拔高、温度低、降水量少、蒸发量大、日照长、昼夜温差大的地区，对环境的抗逆性较强。因此，探究青稞的抗逆机制和光合机制对于选育适应性强、产量高、综合性状优良的青稞品种具有重要的意义。

长期以来，人们试图通过各种手段来提高作物产量，其中提高作物光合速率是提高产量的重要手段，因此，光合机理的研究近年来日益受到研究者的重视[2]。在植物光合作用中，卡尔文循环（Calvin cycle）在CO2的同化过程中发挥着重要作用，其相关酶活性的变化直接影响光合产物的积累。核糖-5-磷酸异构酶（ribose-5-phosphate isomerase，RPIA）、核酮糖-磷酸3-异构酶（ribulose-phosphate 3-epimerase，RPE）、 苹 果 酸 脱 氢 酶 （malate dehydrogenase，MDH） 和果糖 -1,6-二磷酸激酶（fructose-1,6-bisphosphatase，FBP）等均参与了该过程。RPIA是自然界中广泛存在的一种高度保守的蛋白酶，参与原核生物和真核生物的糖代谢（如磷酸戊糖途径），同时在卡尔文循环中必不可少，其能够促使R5P（ribose-5-phosphate）和 Ru5P（ribulose-5-phosphate）进行相互转化[3-4]；RPE在卡尔文循环和磷酸戊糖途径中均发挥着重要作用，其与核酮糖-1,5-二磷酸（ribulose 1,5-bisphosphate）的再生相关[5-6]；MDH 在卡尔文循环中负责将NAD+转化成NADH，提供还原力[7]；FBP在卡尔文循环中负责将果糖-1,6-二磷酸转化成果糖 -6- 磷酸[8]。目前，在水稻[9-10]、玉米[11-13]、油菜[14]、番茄[15-17]、拟南芥[18-20]等植物中大量的光合相关基因已经得到了克隆，而在青稞中还未见报道。因此，我们以青稞品种甘农大7号为材料，进行4个光合作用相关酶编码基因的克隆并做了生物信息学分析，旨在为进一步研究青稞的光合作用提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

青稞品种甘农大7号由西藏自治区农牧科学院农业研究所和青海省农林科学院提供，该品种通过严格的育种选择程序而得到，籽粒饱满，抗白粉病，不耐贫瘠。

1.2 方法

1.2.1 青稞种苗总RNA的提取及反转录。取适量的青稞种子播种于富含有机质的盆栽土壤中，正常浇水管理，待植株生长至2～3片叶时，采用Analytikiena公司的Jena InnuPREP RNA Mini Kit提取新鲜叶片RNA，采用Qiagen公司的TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit进行反转录，cDNA样本于-20℃保存。

1.2.2 4个光合作用相关基因的克隆。以前期不同时期干旱复水诱导转录组测序分析结果为基础，利用Primer Premier 5.0软件分别设计02833、03360、45441和45453这4个光合作用相关基因的特异引物（表1）。

表1 引物列表

RT-PCR反应在S-1000 Thermal Cycler进行，反应体系采用20 μL PCR扩增体积：TaqDNA聚合酶 (TaKaRa，5 U/μL)0.2 μL，10×PCR 反应缓冲液(Takara)2 μL，dNTP(10 mmol/L)1.6 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各 0.8 μL，cDNA 2 μL，灭菌水 12.6 μL。反应条件：94℃变性5 min；94℃变性1 min，58℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，30循环；72℃延伸10 min。分别回收目标片段，克隆于pMD18-T载体上，挑阳性菌测序。

1.2.3 4个基因的生物信息学分析。根据测序得到的02833、03360、45441和 45453基因序列，推测其编码序列（coding sequences,CDS）和氨基酸序列，利用NCBI（http://ncbi.nlm.nih.gov/）、ORFfinder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）、ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）、Conserved domains（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）、TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）、Signal IP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）、PredictProtein（https://ppopen.rostlab.org/）和 SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）等网络资源对02833、03360、45441和45453基因进行序列分析。

图1 02833、03360、45441和45453基因扩增结果

2 结果与分析

2.1 02833、03360、45441和45453基因的克隆

以电子克隆延伸得到的序列为基础设计特异引物，扩增甘农大7号青稞苗期叶片的cDNA，分别特异性获得513、822、1 023和579 bp的4条cDNA序列（图1），测序分析显示这4条片段序列如图2所示，与预期的基因序列基本一致，表明02833、03360、45441和45453基因扩增成功。

2.2 02833、03360、45441和45453基因的生物信息学分析

根据获得的 02833、03360、45441 和 45453 基因序列信息，在NCBI网站进行Blastn比对，结果发现02833可能编码一个核糖-5-磷酸异构酶3，其与山羊草、小麦、二穗短柄草、水稻等核酸序列的相似性分别为92%、88%、86%和85%，NCBI上登陆的02833基因CDS全长为831 bp，编码270个氨基酸，本研究中所得为02833基因的CDS部分片段。

03360可能编码一个核酮糖-磷酸3-异构酶，其与山羊草、小麦、二穗短柄草、水稻等相应核酸序列的相似性分别为96%、96%、93%和88%，根据NCBI在线软件ORFfinder，推测青稞03360的CDS全长为822 bp，进一步以得到的CDS推测氨基酸序列，预测03360基因编码一个273个氨基酸的多肽，分子量为 29.6 kDa，等电点（pI）为 8.61（图 3）；将该氨基酸序列进行Blastp比对后发现，该氨基酸序列属于ICL_KPHMT superfamily家族之一，含有典型的ICL_KPHMT superfamily结构域（图4）；通过TargetP对03360蛋白的转运肽进行分析和预测，发现其不存在转运肽，为胞浆蛋白，利用TMHMM Server V2.0在线软件对03360蛋白的跨膜结构域进行预测分析，结果发现其不存在跨膜区（图5）。

图 2 02833(a)、03360(b)、45441(c)和 45453(d)基因片段测序结果

图3 03360基因CDS及其编码氨基酸的全长序列

图4 03360基因Blastp对比图

图5 03360跨膜结构域预测分析

图6 45441基因CDS及其编码氨基酸的全长序列

45441基因编码一个340个氨基酸的多肽，预测分子量为36 kDa，等电点（pI）为 8.24，这个多肽可能是一个苹果酸脱氢酶，其与山羊草、二穗短柄草、水稻和玉米等核酸序列的相似性分别为96%、92%、88%和87%，根据NCBI在线软件ORF finder，推测青稞45441的CDS全长为1 023 bp，进一步以得到的CDS推测氨基酸序列（图6），将该氨基酸序列进行Blastp比对后发现，该氨基酸序列属于Ldh_1_C superfamily家族之一，含有典型的Ldh_1_C superfamily结构域（图 7）；通过 TargetP对45441蛋白的转运肽进行分析和预测，发现其不存在转运肽，为胞浆蛋白。利用TMHMM Server V2.0在线软件对45441蛋白的跨膜结构域进行预测分析，结果发现其不存在跨膜区(图8)。

45453基因可能编码一个果糖-1,6-二磷酸激酶，其与山羊草序列的相似性为95%。

图7 45441基因Blastp对比图

图8 45441跨膜结构域预测分析

3 结论与讨论

中国具极端条件的耕地面积辽阔，地形复杂，培育适于各种极端环境条件且高产优质的农作物是研究者持之以恒的目标。青稞可以在青藏高原高海拔、高寒的极端条件下生长，对环境有较强的适应性；同时青稞自身具有一定的保健功能。因此，青稞这一特殊种质资源具有很大的利用价值，研究其光合机制对于选育适应极端环境条件的高产优质的农作物具有重要意义。RPIA、RPE、MDH和FBP是光合作用过程中参与卡尔文循环的4个重要的酶，其活性的变化直接影响卡尔文循环的进行，最终对光合产物的合成产生影响。Mantin等从菠菜叶绿体中克隆得到了一个RPIA基因，该基因与卡尔文循环及氧化戊糖磷酸途径相关，推测其编码239个氨基酸[3]；Paul等发现拟南芥RPIA基因RSW10与纤维素合成相关，其突变体中纤维素合成受阻[21]；此外，Schreier等研究发现RPIA还与植物防卫反应相关[22]。这说明，RPIA的功能存在多样性，不仅仅局限于光合作用中。针对RPE的研究发现，RPE在卡尔文循环和磷酸戊糖途径中均发挥着重要作用，其与核酮糖-1,5-二磷酸（ribulose 1,5-bisphosphate）的再生相关[5-6]。Tesfaye等研究发现，在苜蓿中过表达MDH能够提高转基因植株中有机酸的合成，增强植株对铝离子和酸性土壤的适应性[23]，而Nunes-nesi等发现在番茄中反义表达线粒体MDH基因能够增强植株的光合性能[24]。此外，研究表明，MDH在卡尔文循环中负责将NAD+转化成NADH，提供还原力[7]，这说明MDH的功能同样存在多样性，可能与植物光合作用和抵抗逆境密切相关。对FBP的研究发现，其在卡尔文循环中负责将果糖-1,6-二磷酸转化成果糖-6-磷酸[8]。综上，RPIA、RPE、MDH和FBP等除了与光合作用相关外，还可能与植物抵抗逆境相关，进一步研究青稞中这些基因的功能，不仅能够揭示青稞的光合机制，也有可能提供青稞适应极端条件的分子依据。本研究中克隆得到的 02833、03360、45441和 45453基因分别对应于这4个酶的编码序列，这些基因的分离和鉴定为下一步的研究奠定了基础。

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