分化抑制因子1基因在急性髓系白血病患者骨髓单个核细胞中的表达

姚欣妤，周静东，张婷娟，林江，张巍，钱军

（1.江苏大学附属人民医院血液内科，江苏镇江212002；2.江苏大学医学院，江苏镇江212013；3.江苏大学附属人民医院中心实验室，江苏镇江212002）

急性髓系白血病（acutemyeloid leukemia，AML）是一种细胞遗传学和分子生物学异质性较大的恶性克隆性疾病，其特征在于造血干细胞分化阻滞和成熟障碍，导致大量异常细胞即白血病细胞积累继而导致造血功能衰竭[1]。目前已经证实细胞遗传异常和基因突变不仅与疾病发生有关，而且对于疾病预后判断也很重要[2－3]。除遗传学改变之外，基因表达异常也是AML中常见的分子事件，并且可能与疾病的预后密切相关[3]。

分化抑制因子（inhibitor of differentiation，ID）家族基因编码螺旋—环—螺旋（helix-loop-helix，HLH）蛋白，对促进细胞分化的碱性HLH转录因子起负调控作用[4]。ID1是ID基因的家族一员，已经被鉴定为潜在的原癌基因，在细胞增殖以及侵袭中起作用，并保护细胞免受药物诱导的凋亡[4]。多种实体瘤中ID1呈现过表达，并且与预后相关[4]。有少量研究涉及AML患者中ID1呈现过表达趋势，但其临床意义不尽相同[5－6]，其过表达对AML患者预后的影响仍然存在争议。因此，本研究旨在探讨初发AML患者骨髓单个核细胞（bone marrow mononuclear cells，BMMNCs）中ID1表达的临床意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象

153例初诊 AML患者均为2005年10月至2016年7月在江苏大学附属人民医院血液科治疗案例。AML患者的具体临床参数见表1。诊断分型按FAB和2008版WHO标准[7－8]。治疗方案参照本课题组前期报道[9]。

1.2 BMMNCs分离、RNA提取和逆转录

所有AML患者行骨髓穿刺时抽取10 mL血，使用Ficoll密度梯度离心法分离 BMMNCs。总 RNA应用TRIzol（美国Invitrogen公司）提取，并逆转录为cDNA[10]。逆转录总反应体系为 40μL，含总 RNA（2μg）、随机引物（4μL×10μmol/L，日本 TaKaRa公司）、M-MLV逆转录酶（200 U，美国Thermo Fisher Scientific公司）、dNTPs（4μL×10 mmol/L）和 RNA酶抑制剂（25 U，美国 Thermo Fisher Scientific公司）。逆转录反应条件为25℃10 min、42℃60 min。

1.3 实时荧光定量PCR检测ID1表达

目的基因ID1引物序列为5′-CTCAGCACCCTCAACGG-3′（上游）、5′-GATCGGTCTTGTTCTCCCTC-3′（下游）；选取ABL为内参基因，引物序列为5′-TCCTCCAGCTGTTATCTGGAAGA-3′（上 游）、5′-TCCAACGAGCGGCTTCAC-3′（下游），引物由上海华大基因科技有限公司合成。PCR反应体系共20μL，含10μL预染液（AceQ qPCR SYBR Green Master Mix，美国 Vazyme公司）、0.4μL ROX参比染料 1（美国Vazyme公司）、0.8μL上下游引物及20 ng cDNA。PCR反应在ABI 7300扩增仪（美国ABI公司）上进行，反应条件为95℃ 5 min（预变性）、95℃ 10 s（变性）、62℃ 30 s（退火）、72℃ 30 s（延伸）、80℃30 s（收集荧光），共35个循环；熔解曲线程序为95℃ 15 s、60℃ 60 s、95℃ 15 s、60℃ 15 s。每次扩增反应均含阳性对照（重组ID1质粒）和阴性对照（双蒸水）。ID1基因表达相对定量采用2－△△CT计算。

1.4 统计学分析

应用SPSS 20.0软件和GraphPad Prism 5软件进行统计学处理。两组连续性变量间的差异分析使用Mann-WhitneyU检验，分类变量之间的差异比较采用卡方检验或Fisher确切概率法，生存分析采用Kaplan-Meier法；以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ID1表达与AML患者临床参数的关系

ID1基因在AML患者中的表达范围为0.000～3.536（中位为0.030）。以中位数值为界将AML患者分为高表达组和低表达组，两组常见的临床参数比较见表1。两组患者性别、外周血小板计数以及常见基因突变间无明显差异（P＞0.05），外周血白细胞计数、血红蛋白含量、FAB分型、WHO分型、核型分组及核型危险程度分组趋近统计学差异（P＜0.10）。然而，ID1高表达患者年龄以及骨髓原始细胞比例显著高于ID1低表达患者（P＝0.033和0.035）。在 FAB、WHO分型及核型分组中，ID1高表达在 FAB-M3/WHO-t（15；17）中发生频率较低（29%，10/34），而在剩余其他类型中发生频率为56%（67/119），两者之间差异有统计学意义（χ2＝7.649，P＝0.007）。

2.2 ID1表达与AML患者预后的关系

2.2.1ID1表达与患者化疗反应之间的关系 经1～2个疗程诱导化疗后，有随访资料患者131例，ID1高表达患者完全缓解率显著低于ID1低表达患者（P＜0.01，表1）。同时，定量分析发现经1～2个疗程诱导化疗获得完全缓解的AML患者初诊时ID1表达水平显著低于未获得完全缓解的AML患者（U＝1408.0，P＝0.001，图1）。

表1 ID1表达与AM L患者临床参数的关系

续表1

图1 获得完全缓解以及未获得完全缓解的AML患者初诊时ID1表达

2.2.2ID1表达与患者总体生存时间的关系ID1高表达患者的总体生存时间明显低于ID1低表达患者（中位生存时间分别为5个月和14个月，P＝0.002）。在非M3患者中，ID1高表达患者的总体生存时间也明显低于ID1低表达患者（中位生存时间分别为4个月和8个月，P＝0.008）。在正常核型患者中，ID1高表达患者的总体生存时间亦有明显的趋势低于ID1低表达患者（中位生存时间分别为6个月和12个月，P＝0.050）。见图2。

图2 AM L患者ID1表达对总体生存时间的影响

3 讨论

ID1过表达与大多数实体瘤的预后不良相关[4]，但是ID1过表达对AML患者预后的影响仍然存在争议。Tang等[5]报道ID1高表达预示年龄＜60岁的非M3或者正常核型AML患者完全缓解率降低、总体生存时间和无白血病生存时间缩短。然而，Damm等[6]揭示ID1过表达不是正常核型AML患者的独立预后因素，可能是与CEBPA野生型和（或）FLT3-ITD突变相关。我们前期的研究结果显示，ID1过表达与CEBPA及FLT3-ITD等基因突变并无明显相关，可能是由于这些基因突变的频率在中国人群中较低[11－13]。这种差异最可能归因于种族和AML亚型分布的差异[16]。本组资料的预后相关分析显示，ID1高表达与AML患者较低的完全缓解率相关，提示ID1可能参与耐药，进一步的生存分析证实了ID1高表达无论是在全部、非M3还是正常核型AML中都与预后不良密切相关。

此外，本研究还显示ID1表达尤其是在t（15；17）/M3中的表达，与核型显著相关。然而，如果M3患者被排除在分析之外，我们没有观察到ID1表达与核型分型之间的显著相关性，这与国外的研究结果一致[5]。既往研究发现急性早幼粒细胞白血病（即M3）患者原代白血病细胞以及NB4细胞系（M3细胞株）在全反式维甲酸治疗诱导分化后，ID1表达上调，提示ID1是全反式维甲酸的反应基因[14]。此外，ID1过表达抑制增殖并导致NB4细胞中的G0/G1阻滞[15]。然而，后来的研究显示，ID1过表达促进了原始骨髓祖细胞的增殖，ID1沉默抑制了白血病细胞株生长[16]。这些结果表明ID1在白血病发生过程中的作用可能取决于不同细胞遗传学背景。

综上所述，ID1基因表达水平可作为AML患者化疗反应以及预后判断的分子标志。

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