Exendin-4通过下调Wnt5a基因表达促进胰岛β细胞瘤INS-1细胞增殖

吴杏儿，赵丽辉，陈应智，孙世珺

（中山市人民医院1.分子诊断中心，2.病理科，广东 中山528403）

胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）及其受体激动剂 Exendin-4（Exd-4）作为糖尿病治疗药物，对2型糖尿病患者具有刺激葡萄糖依赖的胰岛素分泌、减少胰岛β细胞凋亡及促进β细胞增殖等作用[1]。Exd-4与多个参与调节β细胞功能的细胞内信号通路相互作用，其中包括Wnt信号通路。Wnt信号通路在细胞增殖、存活、迁移及分化等过程发挥重要的调控作用[2－3]。近年研究发现，Exd-4可通过调控如Wnt4等Wnt信号通路配体基因表达，影响β细胞增殖[4]。这种现象提示Wnt配体可能是介导Exd-4调节β细胞增殖活性的重要蛋白分子。Wnt5a是人类及大鼠Wnt配体家族的重要成员，在胰腺组织中基础表达丰度高，对脊椎动物胚胎发育过程中胰岛形成起重要作用。本实验通过研究Exd-4对大鼠胰岛β细胞瘤INS-1细胞中Wnt5a基因表达的调控，探讨Exd-4调控β细胞增殖的新机制。

1 材料与方法

1.1 材料

大鼠胰岛 β细胞瘤 INS-1细胞（ATCC细胞库）。小牛血清和RPMI-1640培养基（美国Gibco公司）；Exd-4、2-巯基乙醇、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、二甲亚砜（美国Sigma公司）；siRNA由广州吉捷生物科技有限公司合成提供（包括无意义序列、序列1、序列2和序列3）；重组人/鼠Wnt5a蛋白（美国R＆D system公司）；EdU试剂盒购自锐博生物技术公司；转染试剂脂质体2000、PCR引物（美国Invitrogen公司）；兔抗鼠Wnt5a抗体、兔抗鼠GAPDH抗体（美国Cell Signal Technology公司）；辣根过氧化酶标记IgG购自杭州弗德生物技术有限公司；Eastep通用型总RNA提取试剂盒、GoScriptTM反转录试剂盒、GoTaq®qPCR Master Mix（美国 Promaga公司）。

荧光定量PCR仪7500（ABI公司）；倒置荧光显微镜（日本奥林巴斯公司）。

1.2 细胞培养

将大鼠胰岛β细胞瘤INS-1细胞培养在37℃、含5%CO2培养箱，每100 mL细胞培养液含有10%

小牛血清、1%青-链霉素双抗、1%2-巯基乙醇35 μL、碳酸氢钠 0.2 g、10μmol/L HEPES 0.1 mL。以含0.25%胰酶消化细胞传代，每隔24 h更换1次培养液。

1.3 Edu标记染色法检测INS-1细胞增殖率

1.3.1 细胞分组 Exd-4刺激细胞实验中细胞分8组：PBS溶剂对照组以及 1、5、10、25、50、75及 100 nmol/L共7个浓度Exd-4处理组。共培养24 h后进行细胞染色计数。

Exd-4及重组Wnt5a蛋白共培养实验中细胞分6组：50 nmol/L Exd-4处理组，50 nmol/L Exd-4＋重组 Wnt5a蛋白5种浓度（50、100、250、500、1 000 ng/mL）共培养组。共培养24 h后进行细胞染色计数。

1.3.2 细胞染色 细胞以 4×104/孔密度种植至铺有盖玻片的24孔板，细胞贴壁后更换培养基，进行转染或共培养，离观察终点2 h前往培养基中加入EdU溶液（终浓度为50μmol/L），按试剂盒说明固定细胞、染色及铺片。

1.3.3 倒置显微镜下计数细胞增殖率 观察Appolo567染色使用550 nm激发光，观察Hoechst3342染色使用350 nm激发光（放大倍数为400×）。每复孔等分4象限，每象限随机拍摄3张不同视野照片并计数，分别计算Hoechst（细胞核）及Appolo（增殖细胞）染色细胞数，Appolo/Hoechst比值为细胞增殖率，每复孔Hoechst染色阳性细胞计数 ＞1 000个。同组设3个复孔，取增殖率平均数及标准差。

1.4 细胞转染

将INS-1细胞分为4组：无意义siRNA转染组，Wnt5a-siRNA-1转染组，Wnt5a-siRNA-2转染组和Wnt5a-siRNA-3转染组。按LipofectamineTM2000转染试剂盒操作说明，分别将含有1μg无意义siRNA，Wnt5a-siRNA-1（上游：5′-CAAGGAAUUCGUGGACGCACGAGAAdTd-3′，下游：5′-UUCUCGUGCGUCCACGAAUUCCUUGdTd-3′），Wnt5a-siRNA-2（上游：5′-GCAUCCUCAUGAACUUGCACAACAAdTd-3′，下游：5′-UUGUUGUGCAAGUUCAUGAGGAUGCdTd-3′）及 Wnt5a-siRNA-3（上 游：5′-GGACAGUAUACAACCUGGCAGAUGUdTd-3′，下游：5′-ACAUCUGCCAGGUUGUAUACUGUCCdTd-3′）稀释液加入含无血清培养基的EP管中混匀，缓慢加入到含1μL LipofectamineTM2000的50μL无血清培养基中，混匀后室温静置20 min形成转染复合物。使用转染复合物培养INS-1细胞6～8 h后吸出转染复合物，换含有血清的培养基继续培养，总培养时间为36 h。收集细胞用于蛋白印迹检测或EdU标记染色进行细胞增殖率计数。

1.5 半定量 RT-PCR检测 INS-1细胞 Wnt5a的表达

将细胞分为3组：PBS溶剂对照组、50 nmol/L Exd-4处理细胞12 h组和24 h组。按试剂盒说明柱提法冰面操作提取对数生长期细胞总RNA，进行逆转录。反应条件：25℃退火5 min，延伸1 h，70℃灭活15 min。cDNA样本－20℃保存备用。RTPCR反应总体系为20μL，包括反转录产物样本5 μL，无酶核酸水4μL，引物0.8μL，Master Mix2×10 μL，CXR100×0.2μL。反应条件：95℃10 min，95℃15 s后60℃1 min（40个循环）。

采用2－△△Ct方法计算Wnt5a相对表达量，内标基因为 β-肌动蛋白。ΔΔCt＝实验组（Ct目的基因－Ct管家基因）－对照组（Ct目的基因－Ct管家基因）。

1.6 蛋白质印迹法检测INS-1细胞Wnt5a的表达

将INS-1细胞分为6组，对照组加入PBS，其余5组分别采用 50 nmol/L Exd-4处理 1、3、6、12、24 h。至观察终点弃去培养基加入RIPA裂解液提取细胞总蛋白。12%SDS-PAGE分离蛋白质，转膜，4%BSA封闭2 h，TBST洗膜3次后加兔抗Wnt-5a一抗（1∶1 000），4℃孵育过夜，洗膜3次加二抗（1∶5 000）室温孵育1 h，洗膜后再在暗室中加入发光剂，显影后定影。以GAPDH为内参，Image J软件灰度扫描图像检测Wnt5a蛋白的表达。

1.7 统计学方法

每组设置3次重复独立实验，每个处理组至少重复3个复孔，采用SPSS 11.0统计软件处理数据，结果均以均数±标准差（±s）表示。采用单因素方差分析或t检验，置信区间为95%，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Exd-4对INS-1细胞增殖的影响

使用不同浓度的Exd-4处理INS-1细胞24 h后，EdU标记染色实验显示，Exd-4呈浓度依赖性促进INS-1细胞增殖。与 PBS组比较，自10 nmol/L浓度起Exd-4能显著提高INS-1细胞增殖率（均P＜0.01）；50 nmol/L Exd-4促进 INS-1增殖达最大效应。见图1。

图1 不同浓度Exd-4对INS-1细胞增殖率的影响

2.2 Exd-4下调INS-1细胞中Wnt5a基因的表达

半定量RT-PCR检测结果显示，Exd-4处理12 h、24 h后，INS-1细胞Wnt5amRNA转录水平比PBS对照组显著下降（均P＜0.05）。见图2。使用50 nmol/L Exd-4刺激细胞进行时间梯度实验，蛋白质印迹检测结果显示，经Edx-4处理6 h后细胞Wnt5a蛋白水平显著下降（均P＜0.01）。见图3。

图2 Exd-4处理后INS-1细胞中W nt5a mRNA的表达

图3 蛋白质印迹检测经Exd-4处理不同时间后INS-1中W nt5a蛋白水平

2.3 Wnt5a对INS-1细胞增殖的影响

蛋白质印迹检测结果显示，3种不同序列siRNA-Wnt5a均能有效沉默INS-1中Wnt5a基因表达（图4）。EdU标记染色法检测结果显示，与无意义siRNA转染组比较，siRNA沉默Wnt5a后细胞增殖率明显升高（P＜0.01）。见图5。上述结果表明，基础状态下Wnt5a是抑制INS-1细胞增殖的重要调控因子。

图4 蛋白质印迹检测经siRNA转染后各组INS-1细胞W nt5A的表达

图5 EdU标记法检测siRNA沉默Wnt5a基因后INS-1细胞增殖率

2.4 Wnt5a介导Exd-4调控INS-1细胞增殖

培养基中加入不同浓度重组Wnt5a蛋白与50 nmol/L Exd-4共培养，EdU标记染色法检测结果显示，与不加Exd-4组比较，加入各种浓度Exd-4均能明显降低INS-1细胞增殖率（均P＜0.01），且呈浓度依赖性。说明重组Wnt5a蛋白呈浓度依赖性拮抗Exd-4对INS-1细胞的促增殖作用。见图6。

图6 EdU标记法检测不同浓度重组W nt5a蛋白对Exd-4诱导的细胞增殖影响

3 讨论

Exd-4作为GLP-1受体长效激动剂，已被体内外实验证实具有促β细胞增殖效应[5]。GLP-1及Exd-4可通过调控细胞内经典Wnt信号通路影响细胞增殖。Exd-4与细胞膜上GLP-1受体结合后引起胞内 cAMP聚集，激活 cAMP依赖蛋白激酶 A（cAMP-dependent protein kinase A，PKA），PKA对β-catenin第675位丝氨酸残基进行磷酸化修饰，使胞质β-catenin稳定性增加，更多β-catenin进入细胞核内与TCF7L2等转录因子结合成具有转录活性的复合体，调节下游有关细胞周期的靶基因表达，促进 β细胞增殖[6]。

遗传高度保守的Wnt信号通路对胚胎及出生后胰岛β细胞的发育和功能调节都有重要的作用[7－8]，该通路的信号分子在胰岛β细胞中有不同程度的表达[9]。然而，既往关于 GLP-1/Exd-4与Wnt信号通路的研究，焦点多集中于Exd-4对该通路受体水平以下的信号调节，至于Exd-4能否调控Wnt信号通路源头——第一信号分子的Wnt配体表达，目前鲜有报道。

Wnt基因家族编码一系列富含半胱氨酸的分泌型糖蛋白，目前已知鼠及人类Wnt基因家族有19个成员，Wnt蛋白通过自分泌、旁分泌及内分泌等方式与细胞膜上受体结合，不同的Wnt亚型对细胞的生物学行为起不同的效应[10]。相关研究显示，在小鼠及斑马鱼等动物胚胎模型中，Wnt5a及其相应受体（如Frizzled-2）在胰岛中广泛表达；对小鼠胚胎过表达Wnt5a cDNA，观察到胰岛组织较对照组缩小；以吗啉基下调斑马鱼胚胎中Wnt5a基因表达后，分泌胰岛素的细胞迁移受到影响，与对照组形成的典型胰岛结构相比，Wnt5a低表达导致多个较小的细胞岛形成[11]。这些实验说明Wnt5a可能对胰岛及β细胞的发育迁移起重要作用。至于Wnt5a对胰岛β细胞增殖起何作用，Wnt5a能否介导Exd-4调控β细胞增殖，目前尚无文献报道。

本研究结果显示，GLP-1受体长效激动剂Exd-4促进大鼠胰岛β细胞瘤细胞系INS-1增殖，并同时抑制Wnt5a基因表达。通过转染siRNA沉默Wnt5a基因并观察细胞增殖率变化，证实Wnt5a是抑制大鼠β细胞瘤细胞增殖的重要调控因子。本研究进一步在细胞培养基中加入鼠/人重组Wnt5a蛋白与Exd-4进行共培养，发现Wnt5a重组蛋白可有效拮抗Exd-4引起的促INS-1细胞增殖效应。上述结果提示Exd-4可能通过调控Wnt5a表达影响β细胞增殖。

目前，尚无研究揭示Exd-4调控Wnt5a基因表达的具体机制。如前述，Exd-4与GLP-1受体结合后通过聚集cAMP激活PKA，有研究指出PKA激活后可抑制TGF-β对下游通路信号分子的诱导表达[12]。在乳腺癌细胞中，TGF-β通过调控转录因子CUTL1而进一步调控其下游的Wnt5a基因表达，增强细胞转移能力[13]。也有报道称Exd-4可下调db/db小鼠肾脏及人间充质干细胞中 TGF-β1的表达[6，14]。故此推测胰岛β细胞中的Exd-4可能通过激活GLP-1受体后抑制TGF-β，从而调控Wnt5a基因表达。但确切的机制还需进一步的实验证实。

本研究发现Wnt5a可抑制大鼠β细胞瘤细胞的基础增殖，并拮抗Exd-4对INS-1细胞的促增殖作用。已有大量研究证实，Exd-4/GLP-1受体通过激活PKA促进β-catenin入核，促进下游如Cyclin D1等细胞周期因子转录[6]。Wnt5a可通过激活CaMKⅡ下调Cyclin D1表达，从而抑制小鼠B淋巴细胞增殖[15]。此外，另有研究显示 Wnt5a可降低β-catenin稳定性，抑制与DNA结合的T细胞因子转录活性从而拮抗经典Wnt信号通路[16]。目前非经典Wnt通路配体Wnt5a调控胰岛β细胞增殖的通路机制尚有待于后续研究进一步探索。

综上所述，本项研究结果显示，Exendin-4通过下调Wnt5a基因表达，促进大鼠胰岛β细胞瘤细胞增殖。该结果提示Wnt5a可能是调节β细胞数量的重要因子。但Exendin-4调控Wnt5a基因表达的具体机制仍有待进一步研究揭示。

[1]Holst JJ.Treatment of type 2 diabetesmellitus with agonists of the GLP-1 receptor or DPP-IV inhibitors[J].Expert Opin Emerg Drugs，2004，9（1）：155－166.

[2]Gordon MD，Nusse R.Wnt signaling：multiple pathways，multiple receptors，and multiple transcription factors[J].JBiol Chem，2006，281（32）：22429－22433.

[3]Moon RT，Kohn AD，De Ferrari GV，et al.WNT andβcatenin signalling：diseases and therapies[J].Nat Rev Genet，2004，5（9）：691－701.

[4]Heller C，Kühn MC，Mülders-Opgenoorth B，et al.Exendin-4 upregulates the expression ofWnt-4，a novel regulator of pancreaticβ-cell proliferation[J].Am J Physiol Endocrinol Metab，2011，301（5）：E864－872.

[5]Wang Q，Li L，Xu E，etal.Glucagon-like peptide-1 regulates proliferation and apoptosis via activation of protein kinase B in pancreatic INS-1βcells[J].Diabetologia，2004，47（3）：478－487.

[6]Liu Z，Habener JF.Glucagon-like peptide-1 activation of TCF7L2-dependentWnt signaling enhances pancreaticβ cell proliferation[J].J Biol Chem，2008，283（13）：8723－8735.

[7]Rulifson IC，Karnik SK，Heiser PW，et al.Wnt signaling regulates pancreaticβcell proliferation[J].Proc Natl Acad Sci U SA，2007，104（15）：6247－6252.

[8]Murtaugh LC.The what，where，when and how ofWnt/β-catenin signaling in pancreas development[J].Organogenesis，2008，4（2）：81－86.

[9]Heller RS，Klein T，Ling Z，et al.Expression of Wnt，Frizzled，sFRP，and DKK genes in adult human pancreas[J].Gene Expr，2003，11（3/4）：141－147.

[10]Kühl M.Non-canonicalWnt signaling in Xenopus：regulation of axis formation and gastrulation[J].Semin Cell Dev Biol，2002，13（3）：243－249.

[11]Kim HJ，Schleiffarth JR，Jessurun J，etal.Wnt5 signaling in vertebrate pancreas development[J].BMC Biol，2005，3：23.

[12]Stratton R，Rajkumar V，Ponticos M，et al.Prostacyclin derivatives prevent the fibrotic response to TGF-βby inhibiting the Ras/MEK/ERK pathway[J].The FASEB J，2002，16（14）：1949－1951.

[13]Ripka S，König A，Buchholz M，et al.WNT5A-target of CUTL1 and potentmodulator of tumor cellmigration and invasion in pancreatic cancer[J].Carcinogenesis，2007，28（6）：1178－1187.

[14]Schinner S，Ulgen F，Papewalis C，et al.Regulation of insulin secretion，glucokinase gene transcription and beta cell proliferation by adipocyte-derived Wnt signalling molecules[J].Diabetologia，2008，51（1）：147－154.

[15]Liang H，Chen Q，Coles AH，et al.Wnt5a inhibits B cell proliferation and functions as a tumor suppressor in hematopoietic tissue[J].Cancer Cell，2003，4（5）：349－360.

[16]Topol L，Jiang X，Choi H，et al.Wnt-5a inhibits the canonical Wnt pathway by promoting GSK-3-independent β-catenin degradation[J].JCell Biol，2003，162（5）：899－908.