紫外分光光度法测定西藏林芝当归根中总黄酮含量△

李　捷　陈依春　贺　学　王世华　张景瑜　吴晓军　张雪伟　姚　欢　巴桑次仁　色里玛　孙芳云*

(1.西藏民族大学基础医学院生命科学基础研究实验室、藏药筛选实验室，陕西　咸阳　712082;　2.西藏甘露藏药股份有限公司，西藏　拉萨　851400)

当归,藏名当庚,为伞形科植物当归的干燥根，生长于海拔2800～4900m高寒阴湿的山坡及林缘，《藏医百科全书》记载,药性味辛性凉。据初步考证西藏当归分布于林芝、昌都、拉萨、日喀则、那曲等地。《晶珠本草》记载：当庚清心热，解毒。藏医药记载，西藏当归是传统藏药，有补血、养血滋补、活血化瘀、调经止痛等作用。

当归的化学成分主要有多糖类、苯酞类、香豆素类、阿魏酸钠、黄酮类、挥发油类化合物及其他成分[1-2]。黄酮类化合物是其主要有效成分之一，黄酮类化合物泛指2个具有酚轻基的苯环通过中央三碳原子相互连接而成的一系列化合物[3]。有研究表明,黄酮类化合物有抗氧化、抗炎、镇痛、调节免疫、抗衰老、降血脂作用[4]。实验表明，从当归中分离到的黄酮类化合物具有抑制NO生成、抗氧化和抑菌杀菌等作用[5-7]。西藏当归中是否含有黄酮类物质未见报道，我们利用西藏林芝种植当归根,对其总黄酮含量进行了测定，为进一步研究西藏当归的药理作用提供理论依据。

1　实验材料

1.1仪器紫外分光光度计(美国PE lambda-25)，电子分析天平(T-214万分天平)，超声提取仪(型号HAD-SY-800，长春乐璞科技有限公司)，低温室不锈钢药品柜(SC18CM4门冰箱)。

1.2试剂芦丁对照品(供UV法含量测定用)：100080-201610，100mg/支，中国食品药品检定研究院提供。三氯化铝：AR，20161008，天津市天力化学试剂有限公司；亚硝酸钠：分析纯，20161020，河南焦作市化工三厂；氢氧化钠：分析纯，西安化学试剂厂；无水乙醇：分析纯，20160626，天津市河东区红岩试剂厂。

1.3药材西藏林芝2017年当归根，由西藏甘露藏药厂提供。

2　方法与结果

2.1林芝当归根总黄酮的提取工艺精密称取西藏林芝2017年当归根粗粉1g, 置于500mL圆底烧瓶, 加入75%酒精60mL和玻璃珠少许，浸泡20min后，加热保持沸腾回流1h，冷却后抽滤得滤液，滤渣再次加入60mL 75%酒精浸泡20min后沸腾回流1h ，冷却抽滤，合并两次滤液。将滤液水浴浓缩至仅剩5mL，转入25mL容量瓶中，用75%酒精稀释定容至刻度，得样品提取原液。

2.2对照品溶液的制备精密称取在120℃减压干燥至恒重的芦丁对照品28.66mg，置25mL容量瓶中, 用无水乙醇定容。精密量取10.00 mL芦丁对照品溶液于50mL容量瓶, 用无水乙醇稀释、定容,摇匀即得芦丁对照品溶液(0.22928mg/mL)。

2.3测定波长的选择精密移取对照品溶液2.00mL置25mL容量瓶中,按顺序依次加入5%NaNO2溶液1mL，摇匀,放置6min,加10% AlCl3溶液1mL摇匀,放置6min,再加入4% NaOH溶液10mL,加蒸馏水稀释至刻度,摇匀，放置15min。精密移取蒸馏水2.00mL，同法配制25mL混合溶液作为空白对照,在200～700nm范围内进行扫描,确定芦丁显色液的最大吸收波长为509nm。

2.4标准曲线的制备精密移取芦丁对照品溶液1.00mL， 2.00mL， 3.00mL， 4.00mL，5.00mL， 6.00mL,分别置于25mL容量瓶中，按顺序依次加入5%NaNO2溶液1mL，摇匀,放置6min,加10% AlCl3溶液1mL摇匀,放置6 min,再加入4% NaOH溶液10mL,并加蒸馏水稀释至刻度,摇匀，放置15min。在波长为509nm处进行检测，然后以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标绘制标准曲线，最小二乘法直线回归，得芦丁回归方程为:A=13.324·C-0.1253，A 为吸光度，C为质量浓度，R2=0.9984，n=5。实验表明芦丁在9.17～55.0μg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.5精密度试验精密量取配置好的西藏林芝2017年当归根样品溶液2.00mL，其余同2.3项下操作,测定吸光度,重复测定6次,结果表明,RSD=1.9%,说明该方法精密度良好。

2.6稳定性试验精密量取配置好的西藏林芝2017年当归根样品溶液2.00mL，其余同2.3项下操作,每隔15min测定一次吸光度,重复测定6次，结果表明,样品吸光度在60min内稳定，RSD=2.1%，说明该方法稳定性良好。

2.7重复性试验平行取西藏林芝2017年当归根药材粉末1g各5份，按2.1项下方法制备样品原液。精密量取2.00mL，其余同2.3项下操作,测定吸光度,林芝根RSD=2.37%，表明该方法重复性良好。

2.8回收率试验精密吸取对照品溶液(浓度为0.1mg/mL)0.2mL,0.3mL各2份,置25mL容量瓶中，分别加入已知含量的西藏林芝根(已测得其总黄酮含量为2.53mg/mL)样品溶液2.00mL,其余按2.3项下进行测定回收率为101.5%，RSD=0.8%，表明该方法科学合理。

3　样品含量测定结果

取西藏林芝2017年当归根药材粉末1g，按2.1项下方法制备样品溶液。精密移取林芝根样品原液2.00mL，其余按2.3项下方法测定吸光度,代入回归方程中。

样品中总黄酮含量计算公式：由线性方程A=13.324·C-0.1253得出。西藏林芝2017年当归根茎中总黄酮的含量测定分别为2.653 mg/g 、2.668 mg/g、2.534 mg/g、2.530 mg/g、2.633 mg/g ，总黄酮均值计算为2.604mg/g。

4　讨论

有文献报道当归总黄酮提取工艺中，乙醇回流法为当归总黄酮的最适提取方法[8]。本人利用现有的实验室条件，以芦丁标准品为对照，经全波长扫描确定最大吸收波长分别为509 nm，在9.17～55.0μg/mL范围内呈现良好的线性关系,回归方程为: A=13.324·C-0.1253, R2=0.9984,n=5, A为吸光度，C为质量浓度，总黄酮回收率为101.5%，在该工艺条件下提取林芝当归总黄酮，得当归总黄酮含量为2.604mg/g。

本研究采用紫外分光光度法回对西藏林芝当归根中总黄酮进行测定，方法学考察显示，该方法显色稳定，重复性、精密度及回收率均达到定量分析的要求，且简便易行，数据较为合理可靠，可用于当归药材的日常检验和质量控制。