禽源沙门氏菌对四环素耐药分析

张博

（辽宁省抚顺市动物疫病预防控制中心113006）

细菌耐药性越来越成为公共卫生关注的焦点，四环素作为家禽养殖业的常用抗生素，其抗菌谱广泛，对革兰氏阳性及阴性菌均有抑制作用，但由于四环素的不合理使用，使得沙门氏菌等致病菌的耐药性逐渐增强。耐药基因作为一种新型的污染物质，与耐药菌的传播有直接关系，本文以禽源性沙门氏菌为研究对象，采用药敏试验和耐药基因检测方法，分析了禽源性沙门氏菌对四环素的耐药情况，为家禽养殖业合理使用四环素类抗生素提供指导作用。

1 材料与方法

1.1 样品分离培养

从辽东地区选择3个育成鸡场，采集健康鸡群非重复肛试子样品，用生理盐水稀释并接种在营养肉汤培养基中培养，再通过麦康凯培养基分离出沙门氏菌。

1.2 药敏试验

按照CLSI标准进行操作[1]，对分离株采用微量稀释法测定沙门菌对四环素的MIC值。沙门菌对四环素的耐药和敏感折点分别为MIC≥16μg/ml和MIC≤4μg/ml， 测定浓度范围为 0.5～16μg/ml，质控菌株为大肠杆菌 ATCC 25922。

1.3 耐药基因检测

根据GenBank已发表耐药基因序列，对分离株进行4种四环素耐药基因： tet（A）、 tet（B）、 tet（C）、 tet（D）检测。根据Ng等[2]研究得到扩增目的基因引物序列及目的片段长度，引物由上海生工合成。PCR体系取模板 cDNA 2.0 μl， 10pmol/μl 上 下 游 引物各 1μl， 混合 Tag酶 9.5μl， 加入灭菌双蒸水至25μl。PCR反应条件为，95℃预变性 5min，94℃变性 30 s， 60℃30 s，72℃30 min，35个循环，72℃延伸10min。取PCR反应产物5μl，于3.0%琼脂糖凝胶中电泳，以检测扩增效果。

2 试验结果

2.1 药敏试验结果

本研究共分离鉴定沙门氏菌34株，通过对耐药性检测结果进行统计分析，结果表明，有30株沙门氏菌对四环素产生耐药性，耐药率为78.9%。

2.2 耐药基因检测结果

通过PCR定性检测发现30株四环素耐药菌中， 对 tet（A）、 tet（C）、 tet（B）均有检出，tet（D）没有检出。其中检出tet（A）的21株，检出tet（C）的15株，检出tet（B）的1株，检出率分别为70%、50%和3.3%。tet（A）的检出率最高，tet（D）的检出率最低。 其中有 21株对 tet（A）、 tet（C）、tet（B）3种基因全部检出。

3 讨论

沙门氏菌是典型的禽类致病菌，四环素作为广谱抗菌药大量地应用在沙门氏菌等细菌病的治疗与预防上，由于其不合理的使用，导致沙门氏菌的耐药性。本研究通过辽宁省东部从3个育成鸡场分离鉴定出沙门氏菌34株，经过药敏试验得出其中30株对四环素产生耐药反应，这说明在临床上治疗禽沙门氏菌病时，应适当减少或取代对四环素的使用。通过基因检测试验可以看出大部分对四环素耐药的沙门氏菌都带有四环素耐药基因，其中tet（A）的检出率最高，这是因为tet（A）基因主要位于结合性质粒或者转座子上，在对四环素耐药的沙门菌中广泛分布，耐药基因的高检出率对细菌耐药性的传播有直接关系，因此，耐药基因 tet（A）、 tet（C）、 tet（B）的传播是造成沙门氏菌对四环素抗生素耐药的主要原因。

[1]Clinical and Laboratory Standards Institute.M100-S18 Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing [M].Wayne,PA:Clinical and Laboratory Standards Institute,2008.

[2]Ng LK,Martin I,Alfa M,et al.Multiplex PCR for the detection of tetracycline resistant genes [J].Molecularand CellularProbes,2001,15（4）:209-215.