猪蓝耳病病毒在白纹伊蚊体内增殖可能性研究

华莹 李涛 陈眷华 林家栋 王开功 余四九

（1，甘肃农业大学动物医学院 730070；2，贵州省动物疫病预防控制中心 550008；3，贵州大学动物科学学院 550025）

猪蓝耳病病毒即猪繁殖与呼吸综合征病毒 （Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）是猪蓝耳病的病原。猪蓝耳病于1987年美国首次发现后，在不到10年时间，PRRS几乎传遍全世界养猪国家，其原因可能与PRRSV存在广泛的传播途径有关。PRRSV除了可以直接接触传播外，可通过感染公猪的精液、污染的用具和车辆等进行传播，还可通过母体胎盘和乳汁传递给仔猪，特别是蚊、蝇、鼠等传播PRRSV[1-3]。但这些研究结果均认为，蚊、蝇、鼠等只能机械性携带PRRSV，不能作为PRRSV的生物性传播媒介。

自2006年夏秋以后，我国南方大部分地区爆发了以PRRSV变异毒株引起的高致病性PRRS，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。这些PRRSV变异毒株的主要变异特点是Nsp2基因90个核苷酸不连续缺失和GP5基因点突变。这些基因变异特别是Nsp2基因的90个核苷酸缺失，导致病毒从以侵害呼吸系统和生殖系统为主扩展到可侵染宿主各个组织器官，从而具有极高的发病率和死亡率。值得注意的是，2006年以来发生的高致病性PRRS疫情主要在夏秋温暖季节[4-6]，这也是蚊虫滋生活动季节。从上述PRRSV组织嗜性改变和PRRS发生季节等特点，可以推测高致病性PRRSV有可能存在生物性媒介。因此，本研究以我国养猪场常见蚊种之一即白纹伊蚊为实验对象，研究观察PRRSV在白纹伊蚊体内增殖的可能性，以期为高致病性PRRSV生物传播机制研究和PRRS预防控制提供理论依据。

1 材料

1.1 毒株和蚊种

实验毒株：PRRSV GY株 （106.5 TCID50），为PRRSV变异毒株，从贵阳市郊区某养猪场的发病猪只体内组织器官分离鉴定并保存。

实验蚊种：白纹伊蚊虫卵，购自四川大学华西基础医学与法医学院寄生虫教研室，购回后在实验室自行孵育和饲养。

1.2 主要试剂

AMV Rtase、 RNase inhibitor、 dNTP （2.5 mmol/L）、 LA Taq DNA聚合酶等，购自大连宝生物工程有限公司；RNA提取试剂盒，为德国QIAGEN公司产品；高糖DMEM培养液、胎牛血清等，为澳大利亚PAA公司产品；其他试剂，均为分析纯。

1.3 主要仪器

Tecnai G2 F20型透射电子显微镜和Leica UC6型超薄切片机，为FEI公司产品；PCR扩增仪，德国Eppendorf公司；凝胶成像仪，上海福玛实验设备有限公司；NanoDrop分光光度计，美国Thermo公司；Galaxy CO2恒温培养箱。

2 方法

2.1 白纹伊蚊饲养

取蚊卵滤纸，放入湿润纱布，置于温度26～28℃和相对湿度80～90%的蚊虫饲养房，光照14h/d，孵育24h，放入自然脱氯48h自来水中，孵育成幼虫 （孑孓）后，加调制呈稀糊状的猪肝粉饲喂，直至孵化成蛹；吸取蛹虫，放入盛有自然脱氯48h自来水的烧杯中，置于50cm×50cm×50cm蚊笼；待其羽化成蚊后，放入含5%葡萄糖水的纱布让其吸食；羽化后3～5d时，加入新鲜猪血让其吸食，放入盛有滤纸和水的烧杯供其产卵。

2.2 蚊吸病毒液制备

取新鲜培养的PRRSV细胞培养物，反复冻融3～5次，4℃ 12000rpm离心10min，取上清液与新鲜猪血按1∶1比例混匀，即为蚊吸病毒液，现配现用。

2.3 白纹伊蚊吸染PRRSV

取羽化3～5d成蚊，停饮葡萄糖水24h，取浸透病毒液的脱脂棉块2块，置于蚊笼底部和顶部，供其吸食1h后放入冰箱冻麻，挑取饱血成蚊移入蚊笼，按常规方法进行饲养，收集不同饲养时间成蚊，放入冰箱冻死备用。

2.4 病毒总RNA提取

取吸染PRRSV后不同时间段的成蚊及其世代样本，生理盐水漂洗后置于预冷研钵，快速研磨并收集至离心管，加入适量RNAisoTM Plus试剂及其1/5体积氯仿，振荡混匀，室温静置5min，4℃12 000r/min离心15min，取上清移至新离心管，加等体积异丙醇，室温静置10min，4℃12 000r/min离心10min，弃上清液，加75%乙醇1ml清洗沉淀，4℃12 000r/min离心5min，弃上清，干燥后用40μl DEPC水溶解，即为蚊虫病毒总RNA样本。

2.5 病毒RT-PCR检测

取蚊虫RNA样本，采用PRRSV N基因引物 （5/-TCATCGCCCAACAAA ACCAG-3//5/-GCGTCGGCAAACTAAACTCC-3/，预期扩增长度为240bp）进行RT-PCR扩增，扩增条件为：42℃水浴反转录1h，94℃预变性10min，94℃变性30s、55℃退火30s和72℃延伸40s，34个循环，72℃延伸10min。取8μl扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果。

2.6 病毒粒子电镜观察

由四川大学分析测试中心电镜室完成，即取成蚊样本，3%戊二醛浸泡固定过夜，PBS清洗，4℃1%锇酸固定2h，PBS清洗，放入30%、50%和70%丙酮醋酸铀，4℃脱水10min，放入80%、90%和100%丙酮中，室温脱水10min；在1∶1纯丙酮/包埋液混液和包埋液浸透2h，包埋后行超薄切片，醋酸双氧铀液染色20min，电子显微镜观察结果。

3 结果

3.1 吸染后白纹伊蚊成虫体内病毒RT-PCR检测结果

取不同时间段白纹伊蚊的总RNA提取样本，采用PRRSV N基因特异性引物进行RT-PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳，结果见图1。

图1 白纹伊蚊体内PRRSV RT-PCR检测结果M：200bp DNA Markers；1：阳性对照；2-12：0h～7d蚊虫样本；13：阴性对照

从图1可看出，吸染PRRSV后0h、6h、12h、18h和24h成蚊样本中可检测出PRRSV N基因特异性片段 （240bp），而吸染PRRSV后30h、36h、42h、48h、120h和168h成蚊样本中均未能检出，说明PRRSV在白蚊伊蚊体内只能存在24h左右，不能长时间存留。

3.2 吸染后白纹伊蚊世代体内病毒RT-PCR检测结果

取吸染 PRRSV后成蚊所产蚊卵孵育 24h、48h、96h、168h幼虫和蛹及其24h、72h成蚊的RNA样本进行RT-PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳，结果见图2所示，在各个世代蚊样本中均未检测出PRRSV N基因特异性片段，提示PRRSV不能在蚊中进行世代传递。

3.2 白纹伊蚊成虫体内病毒电子显微镜观察结果

取吸染PRRSV后12h、24h、48h和120h的白纹伊蚊样品，常规方法固定，送至四川大学分析测试中心电镜室进行超薄切片，电镜观察，结果见图3所示，吸染PRRSV后12h、24h、48h和5d的蚊样本中均未观察到PRRSV病毒粒子，提示白纹伊蚊可能只是机械性携带PRRSV。

4 讨论

我国国土地域辽阔，地理景观复杂多样，媒介昆虫种类繁多，仅蚊虫种类就达600多种。贵州为云贵高原山地，平均海拔500m左右，气候温和，雨水充沛，年平均气温16℃左右，为蚊虫生存提供了适宜的自然条件。研究资料显示，我国南方地区养猪场孳生的主要优势蚊种是三带喙库蚊（Culex tritaenior-hynchus）、 白纹伊蚊 （Aedes albopictus）和致卷伊蚊 （Culex quinquefasciatus）等，其中白纹伊蚊 （Aedes albopictus）是贵州省大部分养猪场的主要优势蚊种之一。白纹伊蚊虽在南方养猪场中的数量没有三带喙库蚊数量多，但其分布比三带喙库蚊广泛，从我国南方向北至沈阳市，西北至陇县、宝鸡市，西南至西藏自治区都有白纹伊蚊的存在，而且外界野生的白纹伊蚊种群数量大，活动季节长，吸血性强，嗜吸人血，兼吸哺乳动物血[7,8]。资料显示，白纹伊蚊可以携带日本乙型脑炎病毒 （Japanese encephalitis virus,JEV）、夏季脑炎病毒 （Spring-summer encephalitis virus,SSEV）、新疆出血热病毒 （Xinjiang haemorrhagic fever virus,XHFV）和登革热病毒 （Dengue fever virus,DENV）等。目前，从事病原生态学或寄生虫学研究的科研院所实验室所驯化的蚊种主要是白纹伊蚊，且主要驯以吸实验白鼠、仔猪等动物血为主。因此，本研究选择白纹伊蚊作为实验对象。

图2 各世代蚊体内PRRSV RT-PCR扩增结果M：100bp DNA Markers，1：阳性对照，2：蚊卵，3-6：1d/2d/4d/7d幼虫；7：蛹，8-9：1d/3d成蚊，10：阴性对照

PRRSV为套式病毒目动脉炎病毒科动脉炎病毒成员，其基因组为单股正链RNA，包含9个开放阅读框，其中ORF7基因即N基因在PRRSV基因组中高度保守，所编码的N蛋白在病毒粒子中含量也高达40%[9,10]。可见，N基因是PRRSV基因组中最保守也是表达量最高的基因，在PRRSV实验室检测上得到广泛的应用。因此，本研究选择N基因作为蚊虫样本中PRRSV检测的首选基因。

病毒的生物性媒介需要具备两个基本条件[11,12]：一是病毒能在其体内进行增殖并达到有效的致病浓度；二是增殖的病毒粒子能在其体内存留5～14d以上。研究资料显示，日本乙型脑炎病毒、登革热病毒等均可在白蚊伊蚊体内进行增殖，具备上述条件，可作为这些病毒的生物性传播媒介。但白蚊伊蚊是否能作为高致病性PRRSV的生物性传播媒介，需要实验证明。本实验通过吸染高致病性PRRSV后，采集不同时间段白纹伊蚊成蚊进行PRRSV N基因检测和蚊虫体内病毒粒子观察，结果显示吸染 PRRSV后0h、6h、12h、18h和24h成蚊样本中检测到PRRSV核酸，时间不超过2d，且电子显微镜观察各个阶段白蚊伊蚊体内均未见到PRRSV病毒粒子。这些结果提示，PRRSV不能在白蚊伊蚊体内进行增殖，也就是说白蚊伊蚊不是PRRSV的生物性传播媒介，只是吸食含PRRSV感染猪血后可机械性携带而已。

图3 不同吸染时间蚊样本电镜观察结果1.吸染12h蚊样本；2.吸染24h蚊样本；3.吸染48h蚊样本；4.吸染120h蚊样本

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