miR-132调控神经环路-突触可塑性与改善卒中后痴呆的机制研究

张雪玲， 王黎明， 陈念东， 杜合宾， 张沈阳， 钱 来， 陈 静， 王一峰

卒中后痴呆是脑卒中后最常见的心理行为障碍并发症，在卒中患者中的发病率为25%～79%。卒中后痴呆主要表现为脑卒中后的情绪低落和兴趣减退，延缓神经功能的恢复，增加死亡率，极大降低了卒中患者的生活质量[1]。虽然卒中是卒中后痴呆的直接原因，但其引起卒中后痴呆的具体机制尚未完全清楚，给治疗带来极大的困难。研究卒中后痴呆的发病机制，寻求早诊断、早预防、早治疗的有效办法，具有重要的社会和科学意义。有研究表明，额叶-皮质下神经环路损害与卒中后痴呆有关，但损害的机制尚不清楚，突触可塑性直接影响神经环路的重塑，从而直接影响认知功能。近年来，miRNAs在转录后水平对突触可塑性的调控越来越受到研究者的关注，有关miRNA调控卒中后痴呆相关的认知神经环路(额叶-皮质下神经环路)突触可塑性研究尚未见报道，miR-132到底调控何种基因影响卒中后痴呆相关的额叶-皮质下神经环路突触可塑性？通过本项研究，期望发现miRNA调控卒中后痴呆相关的额叶-皮质下神经环路突触可塑性的关键基因，为临床早期诊断寻找分子标志物(biomarkers)以及发现治疗卒中后痴呆新靶点，为临床转化奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验步骤 从生物学水平验证miR-132参与卒中后痴呆调控的靶点以及其相关机制 应用水迷宫检测两组小鼠的认知能力，共48只大鼠入组：12只大鼠不作任何处理(对照组)，12只大鼠经大脑中动脉阻塞+慢性温和刺激制作卒中后痴呆模型(卒中后痴呆组)，12只大鼠经大脑中动脉阻塞+脑室注射agomir-132+慢性温和刺激(agomir-132组)，12只大鼠经大脑中动脉阻塞+脑室注射agomir-NC+慢性温和刺激(agomir-NC组)。为确定Grin2A是否参与miR-132抗卒中后痴呆作用,实验将含Grin2A基因的表达质粒经脑室注入卒中后痴呆大鼠脑内。24只大鼠被添加入组：12只大鼠经大脑中动脉阻塞+脑室注射AAV9-CMV-Grin2A质粒和agomir-132+慢性温和刺激(agomir-132+Grin2A组);12只大鼠经大脑中动脉阻塞+脑室注射空质粒和agomir-132+慢性温和刺激(agomir-132+vector组)。

1.2 实验方法介绍

1.2.1 Morris水迷宫 从定位航行实验和空间探索实验评价各组小鼠的认知功能，检测指标包括：逃避潜伏期时间、各象限游泳距离、原平台象限游泳距离与总距离之比等。

1.2.2 脑室注射慢病毒质粒 脑室注射方法参考Nishida等的方法。卒中后痴呆模型的建立:所有大鼠在脑室注射慢病毒质粒48 h后，采用大脑中动脉阻塞法制作脑缺血再灌注模型。

1.2.3 大鼠行为检测 旷野试验：参考Wang等的方法制作敞箱，在安静的情况下将大鼠放入箱内，观察记录大鼠穿越的方格数作为水平活动得分(以大鼠四爪均进入方格为准)，以大鼠直立次数为垂直活动得分(两前肢离地一次为准)。每只大鼠测定3次，每次3 min。蔗糖水消耗试验:禁水禁食20 h后，所有大鼠同时给予1瓶1%浓度的蔗糖水和1瓶清水，计算1 h内大鼠蔗糖水的消耗量(%)=蔗糖水消耗量/(蔗糖水消耗量+清水消耗量)×100%。

1.2.4 实时定量PCR监测miR-132表达 按Duan等的方法进行PCR测定卒中后痴呆大鼠脑内和外周血中的miR-132的表达，步骤如下：总RNA通过Trizol(美国Sigma-Aldrich公司)提取后，使用Easy Script First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(北京全式金公司)进行cDNA合成。2.5 μl合成的cDNA 1 μl特异性引物(广州锐博生物科技有限公司)加入Trans Start T SYBR Green qPCR Supermix(北京全式金公司)后进行实时定量PCR测定miR-132水平，PCR仪(美国ABI公司)检测PCR产物SyBR绿色荧光强度，以小RNA分子U6为内参定量产物浓度。

2 实验结果

2.1 miR-132改善卒中后痴呆小鼠认知功能(水迷宫实验) 实验结果表明，miR-132减少卒中后痴呆大鼠的行为学有改善作用(见图1)。

2.2 过表达Grin2A阻断miR-132对卒中后痴呆大鼠行为学的改善作用 研究结果发现， agomir-132组的大鼠垂直得分(80±0.31)，水平得分(78±0.28)，均高于模型组(P<0.05)，说明miR-132可改善卒中后痴呆相关的额叶-皮质下神经环路的突触可塑性，从而改善PSD小鼠认知功能； agomir-132+Grin2A组的大鼠垂直得分(75±0.26)，水平得分为(73±0.39)；而阴性对照(agomir-132+vector)大鼠垂直得分(78±0.18)，水平得分为(76±0.35)，因此，agomir-132+Grin2A组的大鼠垂直得分以及水平得分均明显低于其阴性对照(agomir-132+vector)和agomir-132组(P<0.05)，说明Grin2A基因的表达可以抑制miR-132调控突触可塑性。同时，agomir-132组糖水消耗百分比为(52±0.59)%；agomir132+Grin2A组糖水消耗百分比为(26±0.58)%；其阴性对照组(agomir-132+vector)糖水消耗百分比为(48±0.32)%，因此，agomir-132组糖水消耗百分比高于模型组和阴性对照组(P<0.05)，说明miR-132对卒中后痴呆大鼠行为学的改善作用；agomir132+Grin2A组糖水消耗百分比明显低于其阴性对照组(agomir-132+vector)和agomir-132组(P<0.05)，表明Grin2A参与了miR-132对卒中后痴呆大鼠的治疗作用(见表1)。

2.3 结论 卒中后痴呆的发病率正受到医学界越来越多的关注。相关研究证明脑卒中后痴呆的发生率与神经功能缺损程度具有相关性。神经退行性疾病是一组典型的迟发的、渐进性的紊乱，能够导致认知和运动障碍。本文通过对大鼠的实验证明，miR-132通过改善额叶-皮质环路突触的可塑性改善卒中后大鼠的认知功能，Grin2A可以阻断miR-132对卒中后痴呆大鼠行为学的改善作用。

表1 过表达Grin2A阻断miR-132对卒中后痴呆大鼠行为学的改善作用

组间比较aP<0.05，bP<0.05，abP<0.05

图1A：miR-132 减少卒中后痴呆大鼠逃避潜伏期；B：miR-132可提高卒中后痴呆大鼠目标象限游泳距离；C：miR-132可提高卒中后痴呆大鼠穿台次数；D：miR-132可提高卒中后痴呆大鼠目标象限时间

3 讨 论

卒中后痴呆(post-stroke dementia，PSD)是指卒中后发生的所有痴呆类型，包括血管性痴呆(vascular dementia，VaD)、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)或其他变性性痴呆以及混合型痴呆。流行病学调查显示，卒中可使痴呆风险增高至少2倍；由于研究人群和研究方法的不同，卒中发病后1 y内的痴呆发生率范围为7.4%～41.3%不等[2]。长期随访研究显示，PSD可对至少半数卒中存活者产生影响，可增高卒中病死率和残疾率，严重影响存活时间。PSD的发病机制涉及炎症反应、氧化应激、谷氨酸兴奋毒性、Ca2+超载、免疫抑制、胆碱能系统功能障碍等多种病理生理学过程[3]。卒中导致关键部位病变，如海马或脑白质病变、微出血等，造成皮质-皮质下环路结构和功能破坏，是PSD发生的主要解剖学机制。

在神经系统中，大量神经元通过突触相互联系形成神经回路。中枢神经系统的兴奋性突触主要以谷氨酸为递质，突触前神经元释放谷氨酸，通过突触后的谷氨酸受体(AMPA和NMDA两种亚型)，将突触前神经元的信号传递到突触后神经元。谷氨酸与AMPA受体结合，使突触后神经元去极化，从而产生脉冲发放,NMDA受体与谷氨酸结合，将突触前电信号转变成突触后神经元内的Ca2+信号，启动一系列生化级联反应，导致突触的可塑性变化[4]。在神经元树突棘上，谷氨酸受体及其偶联的信号转导通路，通过各种支架蛋白形成突触后致密区(PSD)，它含有几百种蛋白质。这种复杂而精巧的棘突结构，是接收突触前信号并进行生化加工的独立单元。树突棘能对接收的大量信号进行神经计算和整合，并依据刺激的方式做出反应，使突触的结构和功能发生相应变化，即形成突触的可塑性。

根据突触功能可塑性变化的性质不同，它可分为长时程增强(long term potentiation,LTP)和长时程抑制(long term depression,LTD)[5]。它们均能选择性地修饰行使功能的突触，使突触连接增强或减弱，因而能贮存大量信息，被认为是学习和记忆的神经基础。突触可塑性可分为与传递效率有关的功能可塑性和与信息贮存相关的树突棘形态变化的结构可塑性。突触不仅能通过对AMPA受体通道的修饰以及AMPA受体插入和迁出突触来增强或抑制突触的传递效率，而且能通过树突棘的增大和萎缩以及棘的消失和新棘的形成使传递效率发生变化[6]。突触可塑性因神经细胞种类、发育阶段、激活方式不同而变化，其形成机制复杂而多样。由于它可能是学习和记忆的神经基础，长期以来一直都是分子和细胞神经生物学的热门研究领域之一。

人源miR132定位于染色体17p13.3，富含于脑组织，尤其是在海马区高表达。miR132在多种神经系统相关疾病或者模型动物中表达下调，包括阿尔茨海默病、胎儿无脑畸形、亨廷顿疾病、精神分类症和双相情感障碍、帕金森病，并且miR132还能影响一些突触相关蛋白的表达，研究证实体外过表达miR132会引起谷氨酸受体NR2A、NR2B、G1uR1的表达上调。有报道显示miR132的生物合成受到CRAB和REST的双向调控，并且随着LTP表达过程中也会平行性的升高。体外实验表明miR132和BDNF以及Mecp2能够形成反馈调节环路[7]。

miR132可以通过抑制一种GTP酶活性依赖蛋白p250GAP的表达而诱导皮质和海马区树突的外向性生长和改变树突的形态，并且体内敲除miR132则会导致突触的减少和抑制新生神经元的迁移。最新研究揭示在原代培养的神经元中敲除miR132导致FOX03a的表达升高而诱导大量的神经元凋亡。另外，选择性在小鼠边缘皮质过表达miR132会引起LTP和LTD的降低而导致短期记忆损伤。miR132：由于参与了众多的神经生理和病理过程而被称为“NeurimmiR”，以上的研究结果也说明miR132涉及到了突触可塑性和学习记忆的过程，但是具体的分子机制现在还不清楚。探索miRl32调控神经环路-突触可塑性对于一些神经退行性疾病的理解和治疗非常有意义。

卒中后痴呆是脑血管病后最常见的心理行为障碍并发症，其发病机制目前尚未明确。目前研究表明，micro RNA与神经发生和突触形成有关，可能在精神疾病中扮演至关重要的作用[8，9]。各种干细胞中均存在特异性的miRNA，并且在干细胞的不同分化阶段亦有特异性miRNA表达，它们是保持干细胞自我更新和多向分化特性的关键分子之一;在细胞的不同发育阶段，miRNA的组成不同，决定了细胞的分化方向以及分化时相，是细胞定时、定向分化的开关[10]。miR-132基因在所有物种中有相同的结构，在大鼠、小鼠和人中2个基因均呈串联排列，分别位于10、11和17号染色体上，称为miR-132基因簇。根据miRNA编码基因在基因组中的位置分为基因间miRNAs和基因内miRNAs。在人的基因组中，miR-132基因簇位于染色体17p13.3，含有3个外显子基因(AK006051)的第1个内含子内，为基因内miRNA。miR-132 可调控多个蛋白。文献报道[11 ]，miR-132抑制p250GAP的翻译过程，调节Rac1或 RhoA来调控突触棘的形态学发生发展。在新生的大鼠海马中，miR132呈低表达，但是在出生后 7～21 d，其表达量增高，与突触发生的活跃期相关。在海马神经元中，抑制miR-132可以减弱突触棘发生的活性以及突触棘的大小，而过表达miR-132可以加强此作用。且miR-132/p250GAP可通过调节突触特异性的kalirin7/Rac1/Pak信号途径来调控Rac1的活性和突触棘发生。另外还有研究表明，BDNF诱导的miR-132表达可以上调突触上的谷氨酸受体，调控突触的结构和功能[12 ]。

本研究发现，miR-132减少卒中后痴呆大鼠逃避潜伏期， miR-132可提高卒中后痴呆大鼠目标象限游泳距离， miR-132可提高卒中后痴呆大鼠穿台次数，miR-132可提高卒中后痴呆大鼠目标象限时间。结果表明，miR-132对减少卒中后痴呆大鼠的行为学有改善作用；同时，本研究表明agomir-132组的大鼠垂直得分和水平得分均高于模型组(P<0.05)，说明miR-132 可改善卒中后痴呆相关的额叶-皮质下神经环路的突触可塑性，从而改善卒中后大鼠的认知功能；agomir-132+Grin2A组的大鼠垂直得分以及水平得分均明显低于其阴性对照(agomir-132+vector)和agomir-132组(P<0.05)，说明Grin2A基因的表达可以抑制miR-132调控突触可塑性。agomir-132组糖水消耗百分比高于模型组和阴性对照组(P<0.05)，说明miR-132对卒中后痴呆大鼠行为学的改善作用，agomir132+Grin2A组糖水消耗百分比明显低于其阴性对照组(agomir-132+vector)和agomir-132组(P<0.05)，表明Grin2A参与并抑制了miR-132对卒中后痴呆大鼠的治疗作用，与国内外研究结果一致，说明miR-132通过调控神经环路-突触可塑性从而改善卒中后痴呆大鼠的行为学特征，Grin2A参与并抑制了miR-132对卒中后痴呆大鼠的治疗作用，该研究结果为临床早期诊断和治疗卒中后痴呆提供新的理念和策略。

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