止得咳颗粒质量标准的研究

黄敏 黄国东 韦瑀龙 谢广源 陆丹萍 吴变美

[摘要] 目的 建立止得咳顆粒的质量标准研究方法。 方法 采用薄层色谱法（TLC）对白前、射干进行定性鉴别；采用高效液相色谱法（HPLC）C18色谱柱测定黄芩苷和次野鸢尾黄素的含量：流动相为甲醇-0.2%磷酸溶液（49∶51）；流速为1 mL/min；检测波长为266 nm。 结果 TLC斑点清晰，阴性无干扰。HPLC定量测定中，黄芩苷和次野鸢尾黄素分别在947.1～7577.0 ng（r = 0.9998）、18.03～180.30 ng（r = 0.9999）范围内线性关系良好，平均加样回收率分别为100.6%（RSD = 0.4%）、93.1%（RSD = 0.6%）。 结论 该方法简便、可行、灵敏、准确，可作为止得咳颗粒的质量控制方法。

[关键词] 止得咳颗粒；黄芩苷；次野鸢尾黄素；白前；射干；薄层色谱；高效液相色谱

[中图分类号] R927.11 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）10（c）-0106-05

[Abstract] Objective To establish a study method for the quality standard of Zhideke Granules. Methods Thin layer chromatography （TLC） was used for the qualitative identification of Cynanchum glaucescens and Belamcanda chinensis. High performance liquid chromatography （HPLC） was used to determine baicalin and irisflorentin by C18 chromatographic column， the mobile phase was methanol-0.2% phosphoric acid solution （49∶51）， the flow rate was 1 mL/min， the detection wavelength was set at 266 nm. Results The TLC spots were clear and free from negative interference. In HPLC quantitative determination， baicalin and irisflorentin showed good linear relationships within the ranges of 947.1-7577.2 ng （r = 0.9998） and 18.032-180.32 ng （r = 0.9999）， whose average recovery were 100.6% （RSD = 0.4%） and 93.1% （RSD = 0.6%）， respectively. Conclusion The method is simple， feasible， sensitive and accurate， which can be used as the quality control method of Zhideke Granules.

[Key words] Zhideke Granules； Baicalin； Irisflorentin； Cynanchum glaucescens； Belamcanda chinecsis； Thin layer chromatography； High performance liquid chromatography

止得咳颗粒由桔梗[1]、白前[2]、枇杷叶[3]、射干[4]、柴胡[5]、黄芩[6]等10味中药经科学配伍而成，具有清热解毒、止咳化痰的功效，临床上用于感冒发热、头痛、喷嚏、急慢性气管炎、肺炎咳嗽、喉炎。本品为广西中医药大学附属瑞康医院医疗机构制剂，其质量控制方法简单，无鉴别、含测等专属性强的检测项目，为了能更好地控制产品质量[7]，本研究参考2015版《中国药典》各味药材质量检测标准[8]、广东省中药材标准第一册[9]及广西壮族自治区壮药质量标准第二卷[10]，基于样品提取和色谱条件的优化，选取白前和射干作为定性鉴别成分，另选取黄芩活性成分黄芩苷、射干活性成分次野鸢尾黄素作为含量测定指标性成分，建立准确性好、专属性强的质量检验方法，用于该品种制剂的质量控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪、十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（Agilent Extend C18 250 mm×4.6 mm，5 μm；YMC-pack ODS-A 250 mm×4.6 mm，5 μm；Spolar C18 250 mm×4.6 mm，5 μm）；AB265-S十万分之一电子天平（梅特勒-托利多）；SQ8200HBT超声波清洗器（上海冠特超声仪器有限公司）；AXLC1820超纯水机（重庆阿修罗科技发展有限公司）；薄层板（青岛海洋化工厂）；紫外分析仪（北京宾达英创科技有限公司）。

1.2 样品与试剂

样品：止得咳颗粒（广西汇科药物研究有限责任公司，批号：170701、170702、170703）；缺黄芩、射干的双阴性样品（广西汇科药物研究有限责任公司）；对照药材：白前（批号：121442-200501）、射干（批号：120994-201206）；对照品：射干苷（批号：11632-200602）、黄芩苷（批号：110715-201612）、次野鸢尾黄素（批号：111557-200602），对照品与对照药材均来自中国食品药品检定研究院。试剂：甲醇（色谱纯），水（超纯水），其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱定性鉴别

2.1.1 白前药材的鉴别

2.1.1.1 白前对照药材溶液 取白前对照药材1 g，加水50 mL，加热回流1 h，放冷，用棉花滤过，取滤液，用氨试液饱和的正丁醇振摇提取2次，每次30 mL，合并正丁醇提取液，用正丁醇饱和的水50 mL洗涤，弃去水洗液，正丁醇层蒸干，残渣加乙醇1 mL使溶解，制成白前对照药材溶液。

2.1.1.2 供试品溶液 取本品15 g，研细，加水50 mL使溶解，用氨试液饱和的正丁醇溶液振摇提取2次，每次50 mL，自“2.1.1.1”项下合并正丁醇提取液起，同法制成供试品溶液。

2.1.1.3 鉴别方法 吸取供试品溶液和白前对照药材溶液各10～15 μL，分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-冰醋酸（4∶8∶0.05）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视，结果见图1（封四）。由图1可知，供试品在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，且斑点清晰，分离度与比移值均良好。

2.1.2 射干药材的鉴别

2.1.2.1 射干苷对照品溶液与射干对照药材溶液 取射干对照药材1 g，加水30 mL，超声提取30 min，滤过，用乙酸乙酯提取2次，每次30 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，制成射干对照药材溶液。再取射干苷对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为射干苷对照品溶液。

2.1.2.2 供试品溶液 取本品8 g，研细，加水30 mL使溶解，自“2.1.2.1”项下合并乙酸乙酯液起，同法配制作为供试品溶液。

2.1.2.3 鉴别方法 吸取供试品溶液和射干对照药材溶液、射干苷对照品溶液各2～5 μL，分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷-丁酮-甲醇-冰醋酸（3∶1∶1∶0.1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254 nm）下检视，结果见图2。由图2可知，供试品在与对照品和对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，且斑点清晰，分离度与比移值均良好。

2.2 HPLC定量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Extend C18 250 mm×4.6 mm，5 μm；流动相：甲醇-0.2%磷酸溶液（49∶51）；流速：1 mL/min；检测波长：266 nm；柱温：30℃；进样量：10 μL。

2.2.2 溶液的制备

2.2.2.1 供试品溶液 取止得咳颗粒样品研磨，取粉末约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%乙醇25 mL，称定重量，密塞，超声处理（功率250 W，频率50 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用75%乙醇补足减失的重量，摇匀。

2.2.2.2 双阴性样品溶液 取缺黄芩与射干的双阴性样品，与“2.2.2.1”同法配制。

2.2.2.3 对照品储备液与对照品溶液 ①黄芩苷对照品储备液与对照品溶液：取黄芩苷对照品50.38 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容稀释至刻度，摇匀，作为黄芩苷对照品储备液；精密量取2 mL，加甲醇定容至10 mL作为黄芩苷对照品溶液。②次野鸢尾黄素对照品储备液与对照品溶液：取次野鸢尾黄素对照品11.27 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容稀释至刻度，摇匀，作为次野鸢尾黄素对照品储备液；精密量取5 mL，加甲醇定容至100 mL，作为次野鸢尾黄素对照品溶液。

2.2.3 专属性试验

分别吸取对照品溶液、样品溶液（批號：170703）及双阴性样品溶液各10 μL，依法测定。结果见图3。结果显示阴性样品在主峰出峰位置无吸收峰，提示阴性样品无干扰，方法专属性良好。

2.2.4 线性关系考察

分别精密量取黄芩苷对照品储备液，逐步稀释成浓度为0.094 71、0.1894、0.3789、0.5683、0.7577 mg/mL的线性系列溶液。精密量取次野鸢尾黄素对照品储备液，逐步稀释成浓度为1.803、3.606、4.508、7.213、9.016、18.03 μg/mL的线性系列溶液。按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，记录图谱。以进样量C（x，ng）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标进行线性拟合，得回归方程。黄芩苷：y = 1.9750x + 75.5497，r = 0.9998。次野鸢尾黄素：y = 4.2999x - 2.2947，r = 0.9999。结果显示黄芩苷和次野鸢尾黄素分别在进样量为947.1～7577.0 ng和18.03～180.30 ng范围内线性关系良好。

2.2.5 重复性试验

取止得咳颗粒样品，按照“2.2.2.1”平行制备6份供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，记录图谱，计算黄芩苷、次野鸢尾黄素的含量及相对标准偏差。结果6份供试品溶液黄芩苷平均含量为4.260 mg/g，RSD为0.6%；次野鸢尾黄素平均含量为84.73 μg/g，RSD为1.4%，表明方法重复性良好。

2.2.6 精密度试验

取黄芩苷对照品溶液、次野鸢尾黄素对照品溶液按“2.2.1”项下色谱条件连续进样5次，记录图谱。结果两组分峰面积RSD分别为0.1%和0.3%，表明该仪器精密度良好。

2.2.7 稳定性试验

取“2.2.5”项下重复性样1溶液分别于室温下放置0、4、8、16、24 h时按照“2.2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。结果显示样品黄芩苷、次野鸢尾黄素峰面积RSD分别为0.6%和2.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.8 加样回收率试验

取已知含量的止得咳颗粒样品约1 g，平行称取6份，黄芩苷对照品储备液（0.9321 mg/mL）5 mL、次野鸢尾黄素对照品储备液（0.036 06 mg/mL）2.5 mL，依法测定，记录图谱并计算加样回收率，结果见表1～2。

2.2.9 耐用性试验

取供试品溶液，分别改变“2.2.1”项下色谱柱品牌（Agilent Extend C18 250 mm×4.6 mm，5 μm；YMC-pack ODS-A 250 mm×4.6 mm，5 μm；Spolar C18 250 mm×4.6 mm，5 μm）、流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）、柱温（25℃、30℃、35℃）、波长（261、266、271 nm）、流动相比例甲醇-0.2%磷酸溶液（46∶54、49∶51、54∶46），依法测定。结果显示在改变色谱柱品牌、流速、柱温、波长及流动相比例时，样品测定结果相对标准偏差分别为黄芩苷：0.20%、0.20%、0.78%、0.54%、0.61%；次野鸢尾黄素：0.41%、0.51%、0.65%、0.42%、0.35%。各试验条件下主峰分离效果良好，黄芩苷主峰理论塔板数均>2000，提示方法耐用性良好。

2.2.10 样品测定

分别取3个批号的样品照本方法进行分析测定，结果见表3。

3 讨论

3.1 薄层色谱定性鉴别

3.1.1 白前药材的鉴别

由于《中国药典》无白前药材的鉴别方法，同时考虑到本品药材较多，干扰大。在选择提取方法的时候考虑用不同浓度的碱液溶解，并用乙酸乙酯多次提取，但最终结果均不如本研究中的提取方法斑点清晰。笔者同时对白前鉴别方法的展开剂也进行了研究：①三氯甲烷-甲醇-水（2∶1∶1.5）下层液[11]；②三氯甲烷-甲醇-水（3.5∶1∶1.5）下层液；③甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（5∶6∶3∶1）[12]；结果显示斑点均不够圆整，比移值太高，而本研究中收载的展开剂效果好，比移值适中，斑点清晰，重现性好。

3.1.2 射干药材的鉴别

除本研究中选择的提取方法，笔者亦选取药典中射干药材的鉴别方法研究，但斑点不明显，同时也比较以下展开系统：①三氯甲烷-丁酮-甲醇（10∶5∶1）[13]；②三氯甲烷-甲醇-冰醋酸（20∶3∶0.5）[14]；结果显示①斑点不够圆整，②特征斑点不明显，而本研究中收载的展开剂效果好，比移值适中，斑点清晰，重现性好。

3.2 HPLC定量测定研究

3.2.1 定量测定成分的选择

笔者参考产品中10味药材的质量标准，在对白前和射干药材进行定性鉴别的基础研究上，对比研究枇杷叶、桔梗、柴胡、黄芩、射干等药材的含量测定的方法，由于处方中中药成分较多，组分复杂，各组分峰之间难分离，同时考虑各药材在成品中的功效，选取黄芩中黄芩苷[15]与射干中次野鸢尾黄素[16-17]作为本品质量研究的主成分。

3.2.2 测定波长的选择

《中国药典》中“黄芩”与“射干”的“含量测定”项下波长分别为280 nm及266 nm。本方法同时测定黄芩苷和次野鸢尾黄素2种成分，但样品中黄芩苷响应大，而次野鸢尾黄素响应较低，故选择266 nm作为本方法的检测波长。

3.2.3 样品提取方法的选择

分别以70%乙醇、乙醇、甲醇、70%甲醇为溶剂采用超声提取和回流提取的方法对试验的结果对比研究。结果显示本方法70%乙醇作为溶剂得到的含量较高，峰型较好，而超声30 min提取效果与加热回流1 h结果无明显差别，但超声提取省时、操作简便。而在对超声时间进行考察时，结果显示超声20 min与40 min的结果与30 min无明显差异，故本法选取超声30 min作为样品提取的条件。

3.2.4 流动相比例的选择

结合《中国药典》2015版一部中黄芩、射干含量测定的方法及相关文献资料调整流动相比例[18]，考虑到梯度洗脱时，系统精密度与重复性较等度洗脱差，且梯度洗脱程序平衡时间较长，故本法选择等度洗脱，同时对不同比例的甲醇-0.2%磷酸溶液进行调整，建立了能同时测定黄芩苷和次野鸢尾黄素的定量分析方法，经过一系列方法学项目验证试验[19-20]，表明本方法简便、分离效果好、准确、重复性好。

综上所述，本文建立的质量控制方法专属性强、准确性高、重现性好，能较好地控制产品质量，但配方中桔梗、枇杷叶等药味还有待建立专属性强的控制方法，进一步完善止得咳颗粒的质量标准。

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（收稿日期：2018-04-08 本文编辑：张瑜杰）