数据挖掘技术分析hMTERF1在胃癌中的表达及预后作用

孙美涛，自加吉，杨勇琴，严长宝，戴莉萍，余 敏，熊 伟*

(1. 大理大学 基础医学院，云南 大理 671000；2. 大理州人民医院 病理科，云南 大理 671000；3. 云南大学 生命科学学院，昆明 530061)

胃癌是源自胃黏膜上皮的恶性肿瘤，占消化道恶性肿瘤的首位[1]。中国是胃癌高发国家，每年约有17万人死于胃癌，是一种严重威胁人类身体健康和生命的疾病[2]。其发生、发展机制颇为复杂，涉及一系列的遗传学改变[3]。从分子水平研究胃癌发生、发展的机制有利于开发新的治疗手段，对减轻病人的痛苦和延长生命尤为重要。

人线粒体转录终止因子1(human mitochondrial transcription termination factor 1, hMTERF1)基因是人类MTERF超基因家族中最早被发现的第1个成员[4]。目前，已确定hMTERF1基因位于7q21.2，基因全长7 845 bp，其含有4个外显子和3个内含子[5]。hMTERF1蛋白由399个氨基酸残基构成，具有3个亮氨酸拉链结构和2个独立的DNA结合区[6]。该蛋白与线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)上编码16S rRNA基因与tRNALEU(UUR)基因分界处的一段28 bp的序列特异结合，从而终止mtDNA重链的转录[7]。有研究发现，与hMTERF1蛋白结合的线粒体tRNALEU(UUR)基因A3243G位点的碱基突变，将引起老年性糖尿病、线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作综合症、进行性眼外肌麻痹等线粒体疾病。mtDNA靶序列A3243G点突变引起hMTERF1与DNA亲合力下降，但并不改变线粒体转录产物的比例，但线粒体蛋白质合成能力和细胞的呼吸活性下降将导致线粒体疾病[8]。但目前为止，关于hMTERF1基因与胃癌的关系尚未见相关报道。本文基于BioGPS数据库、Oncomine数据库以及Kaplan-Meier Plotter数据库的数据挖掘分析hMTERF1基因在胃癌中的表达及意义，为阐明hMTERF1基因在胃癌发生发展中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 Bio GPS数据库分析hMTERF1在正常组织中的表达

利用BioGPS数据库[9](http://biogps.org/)分析hMTERF1基因(204871_at)在人体正常组织中的表达。

1.2 Oncomine数据库提取数据

Oncomine数据库[10]是一个基于基因芯片的数据库和整合数据挖掘平台，在此数据库中可根据自己的需要设定筛选条件。本文设定的筛选条件为：1)“Gene: MTERF1”；2)“Analysis Type: Cancer vs. Normal Analysis”；3)“Cancer Type: Gastric Cancer”；4)“Date Type: mRNA and DNA copy number”；5)“Sample Type: Clinical Specimen”；6)临界值设定条件(Pvalue<0.000 1, fold change 2, gene rank=top 10%)。

1.3 Kaplan-Meier Plotter进行患者生存周期分析

利用Kaplan-Meier Plotter数据库[11]( http: //kmplot. com/analysis/) 的胃癌数据集进行在线生存分析。筛选条件如下:1)“Cancer: Gastric Cancer”; 2)“Gene: MTERF1”; 3)“Survival: OS”; 4)“Lauren classification: all/intestinal/diffuse/mixed”。

1.4 hMTERF1在不同分期胃癌患者中的预后作用

设置截尾数据为OS，然后探针选择为JetSet，所需的有效Affymetrix ID: 204871_at (MTERF1)，在Stage 选项下面分别选择1、2、3、4期，Lauren classification选项下面分别选择all/intestinal/diffuse/mixed，在线分析hMTERF1在不同临床分期的胃癌患者中的预后作用。

1.5 统计学分析

胃癌组织与正常胃组织中hMTERF1基因表达差异采用t检验。hMTERF1基因表达与患者预后的关系采用Kaplan-Meier模型进行生存分析，两组间生存率的比较采用Log-Rank检验，检验水准α=0.05。

2 结果分析

2.1 hMTERF1蛋白在正常组织中的表达

BioGPS数据库显示，hMTERF1蛋白在人体各个正常组织中均有表达，其中在心肌组织、子宫体和骨骼肌组织中含量较高，如图1所示。由此可知，hMTERF1蛋白在机体新陈代谢旺盛的组织中呈现高表达，所以hMTERF1是一种典型的线粒体蛋白质。

图1 BioGPS 数据库显示hMTERF1在人体各种组织中的表达Fig.1 BioGPS microarray expression data for hMTERF1 in different human tissues

2.2 hMTERF1在所有肿瘤类型中的表达

Oncomine数据库中共收集了946个不同类型的基因芯片研究结果，其中关于hMTERF1表达有统计学差异的研究结果共152个，hMTERF1表达增高的研究有59个，hMTERF1表达降低的研究有93个(如图2所示)。在人类消化道系统常见的恶性肿瘤中，食管癌中高表达的研究有2个，低表达的研究有2个；胃癌中高表达的研究有4个，低表达的研究有5个；肝癌中高表达的研究有2个；结直肠癌中高表达的研究有2个，低表达的研究有8个。

图2 hMTERF1在Oncomine数据库所有肿瘤相关研究中的表达Fig.2 All the related research of tumor the hMTERF1 in Oncomine database

2.3 hMTERF1在胃癌中的表达结果

Oncomine数据库中检索发现，从2003年至今，共有20项研究涉及hMTERF1在胃癌组织和正常胃组织中的表达，共计798个样本(如图3所示)。相关的文献分别发表在Mol Biol Cell[12]、Clin Cancer Research[13]、Nucleic Acids Research[14]、Gut[15]、Med Oncol[16]期刊。详细分析20项研究结果发现，与正常胃组织相比，hMTERF1在胃癌组织中呈现高表达，中位数值为4 728.5，P=0.003，表明其高表达具有显著性差异。

2.4 hMTERF1在不同类型胃癌组织和正常胃组织的表达差异

对Oncomine数据库的数据挖掘显示，相比正常胃组织，hMTERF1基因在弥漫型胃癌组织、肠型胃癌组织和混合型胃癌组织中均呈高表达，且差异具有统计学意义(P<0.050)，如图4所示。

图3 hMTERF1在Oncomine数据库胃癌研究中的表达Fig.3 Expression of hMTERF1 in gastric cancer in the studies identified in the Oncomine database

注：1-20分别表示20项研究结果，红色越深表示hMTERF1基因在该芯片中表达越高。

图4 Oncomine 芯片数据库中hMTERF1在不同胃癌组织中的表达情况Fig.4 Expression of hMTERF1 mRNA evaluated in gastric cancers by using Oncomine database analysis

2.5 hMTERF1表达水平与胃癌患者预后的关系

为进一步明确hMTERF1表达水平与胃癌患者预后之间的关系，本文在Oncomine数据库中提取hMTERF1基因表达水平与胃癌患者预后相关的数据，通过Kaplan-Meier Plotter数据库分析发现：与hMTERF1高表达组相比，hMTERF1低表达组胃癌患者的累积生存时间增高(HR=1.19,P=0.045)，说明hMTERF1表达是胃癌患者预后的风险因素。在肠型胃癌患者中，hMTERF1高表达胃癌患者的生存时间增高(HR=0.69,P=0.028)，说明hMTERF1表达是肠型胃癌患者预后的保护因素。在弥漫型胃癌患者中，hMTERF1低表达胃癌患者的生存时间增高(HR=1.48,P=0.024)，说明hMTERF1表达是弥漫型胃癌患者预后的风险因素。在混合型胃癌患者中，hMTERF1高表达患者与低表达患者生存时间的差异无统计学意义(HR=0.57,P=0.310)，如图5所示。

图5 Kaplan-Meier Plotter数据库分析hMTERF1对胃癌患者预后的影响Fig.5 Relationship between the expression of hMTERF1 and the prognosis of gastric cancer Unicariate Kaplan-Meier survival analysis performed using datasets compiled at Kaplan-Meier Plotter

2.6 各个分期胃癌患者的预后与hMTERF1 mRNA水平的关系

在所有不同类型的胃癌中，早期胃癌患者(2期)hMTERF1表达水平越高，患者预后越差(HR>1)，说明hMTERF1表达对胃癌患者的总体生存率(OS)为风险因素。在肠型胃癌中，早期、中期和晚期hMTERF1 表达水平越高，患者预后越好(HR<1)，说明hMTERF1表达对不同分期的肠型胃癌患者均为保护因素。在弥漫型胃癌中，胃癌患者(2期+3期)hMTERF1 表达水平越高，患者预后越差(HR>1)。在混合型胃癌中，由于数据库中的样本量有限，未能获得相关数据，见表1。

表1各个分期胃癌患者的预后与hMTERF1mRNA水平的关系

Table1TherelationshipofhMTERF1mRNAlevelsandtheprognosisofdifferentstageofgastriccancerpatients

患者类型阶段HR95%C．I．P⁃value胃癌1(n=67)0．50(0．19～1．33)0．1602(n=140)1．63(0．89～3．01)0．1103(n=305)0．74(0．55～0．99)0．0404(n=148)0．69(0．44～1．08)0．110肠型胃癌1(n=45)0．47(0．12～1．81)0．2702(n=75)0．61(0．23～1．66)0．3303(n=134)0．77(0．49～1．19)0．2404(n=63)0．45(0．21～0．97)0．037弥漫型胃癌1(n=14)--2(n=53)1．99(0．70～5．66)0．1903(n=99)1．49(0．85～2．61)0．1604(n=74)0．72(0．42～1．24)0．240混合型胃癌1(n=4)--2(n=7)--3(n=14)--4(n=7)--

注：HR为风险比； 95% C.I.为95%可信区间

3 讨 论

胃癌是常见的消化道恶性肿瘤，是严重危害人类健康和生命的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率较高，以中老年居多[17-18]。在中国，胃癌的死亡率位居所有恶性肿瘤的第3位[19]。胃癌的发生是一个复杂的过程，是多基因、多因素及其相互作用的结果[20]。近年来国内外学者对mtDNA与恶性肿瘤发生发展之间的关联提出一些假说，已有的研究资料显示肿瘤的发生不仅取决于核内遗传物质，而且与核外的mtDNA有一定的联系。mtDNA是环境致癌物作用的重要靶标，其损伤程度和突变率显著高于核内DNA。

MTERF1蛋白是线粒体转录终止因子(MTERF)蛋白家族的第1个成员，也是最早被发现的MTERF蛋白[21]。MTERF1蛋白广泛存在于后生动物与植物中。蛋白质相互作用分析表明，MTERF1蛋白与线粒体转录起始因子A(mitochondrial transcription factor A, TFAM)、线粒体RNA聚合酶(mitochondrial RNA polymerase, PLORMT)和线粒体转录延伸因子(mitochondrial transcription elongation factor, TEFM)等蛋白存在相互作用，共同参与线粒体基因复制、转录、氧化磷酸化活性和细胞周期等的调控[22]。Haväinen等[23-24]发现，在人胚肾293T细胞内过表达MTERF1，将导致mtDNA复制的终止和mtDNA拷贝数的下降，而且MTERF1蛋白在协调mtDNA的复制和转录过程中发挥重要的作用。Chen等[25]对人类宫颈癌HeLa细胞株的体外研究发现，hMTERF1蛋白可调控肿瘤细胞的线粒体基因表达和氧化磷酸化水平，从而促进肿瘤细胞的增殖，这为探讨hMTERF1在肿瘤细胞的发生发展提供了新的视角。目前，hMTERF1在胃癌中的表达及其预后意义还未见相关报道。

BioGPS数据库是一个在线的基因注释数据库，包含了公共资源的信息以及诺华研究部门所产生的数据。基于BioGPS数据库挖掘的结果显示，hMTERF1蛋白在人体正常组织中均有表达，尤其在心肌组织、子宫体和骨骼肌组织等新陈代谢旺盛的组织中表达较高，是一个典型的线粒体蛋白质。Oncomine数据库是目前世界上最大的基因芯片数据库和整合数据挖掘平台，其中的所有数据都来自基因芯片，研究方法一致。本文利用该数据平台避免了因为样本量的问题导致的误差，增加了结论的可信度[26]。本文分析结果显示，相较于正常胃组织，hMTERF1在不同类型的胃癌组织中均表达增高，且差异具有统计学意义(P<0.050)。

1965年Lauren根据胃癌的组织结构和生物学行为，将胃癌分为肠型和弥漫型。肠型胃癌起源于肠化生黏膜，一般具有明显的腺管结构，瘤细胞呈柱状或立方形，可见刷状缘，瘤细胞分泌酸性黏液物质，类似于肠癌的结构；常伴有萎缩性胃炎和肠化生，多见于老年男性，病程较长，发病率较高，预后较好。弥漫型胃癌起源于胃固有黏膜，癌细胞分化较差，呈弥漫性生长，缺乏细胞连接，一般不形成腺管，许多低分化腺癌和印戒细胞癌属于此型；多见于年轻女性，易出现淋巴结转移和远处转移，预后较差。Lauren分型简明有效，常在病理研究中应用。但有10%～20%的病例兼有肠型和弥漫型的特征，难以归入其中任何一种，从而称为混合型。关于hMTERF1蛋白表达水平对胃癌患者预后的影响，目前为止一直缺乏强有力的证据和实验研究。本文通过数据挖掘发现hMTERF1在不同Lauren分型的胃癌患者中的预后有所差异。与hMTERF1高表达组相比，hMTERF1低表达组胃癌患者的累积生存时间增高，差异有统计学意义(P<0.050)，说明hMTERF1表达是胃癌发生的风险因素(HR=1.19)。在肠型胃癌患者中，hMTERF1高表达胃癌患者的生存时间增高，差异有统计学意义(P<0.050)，说明hMTERF1表达是肠型胃癌的保护因素(HR=0.69)。而在弥漫型胃癌患者中，hMTERF1低表达胃癌患者的生存时间增高，差异有统计学意义(P<0.050)，说明hMTERF1表达是肠型胃癌的风险因素(HR=1.48)。在混合型胃癌患者中，hMTERF1高表达患者与低表达患者生存时间的差异无统计学意义(P>0.050)，既不是预后的保护因素也不是风险因素。目前，hMTERF1在胃癌发生发展中具体的作用及其分子机制仍不清楚。上述结果表明，hMTERF1在不同类型的胃癌组织中可能具有不同的病理作用，其表达水平与不同类型胃癌患者的预后关系存在差异，亟待进一步通过免疫组织化学和Western blot技术在蛋白质表达水平上分析验证hMTERF1在不同类型胃癌组织中的表达水平。hMTERF1蛋白将有望成为判别不同类型胃癌的一个潜在的生物标记物。

综上所述，本文通过对BioGPS数据库、Oncomine基因芯片数据库和Kaplan-Meier Plotter数据库中肿瘤相关基因信息的深入挖掘，提出hMTERF1在胃癌组织中高表达，且与胃癌的预后相关。通过对数据库进行大样本量的数据挖掘和分析，可以避免单一研究样本量过小导致的误差，为胃癌的临床治疗提供重要的线索和思路。

4 结 论

1) 利用BioGPS数据库分析hMTERF1在正常组织中的表达，发现hMTERF1在人体正常组织中均有表达，其中在心肌组织、子宫体和骨骼肌组织中含量较高。

2) 利用Oncomine数据库对hMTERF1基因在胃癌中的表达进行汇总分析，发现与正常胃组织相比，hMTERF1在胃癌组织中呈现高表达，且差异具有统计学意义(P=0.003)。

3) 利用Kaplan-Meier Plotter数据库分析hMTERF1表达对不同Lauren分型胃癌患者生存时间的影响，结果显示，与hMTERF1高表达组相比，hMTERF1低表达组胃癌患者的累积生存时间增高(P=0.045)。在肠型胃癌患者中，hMTERF1高表达胃癌患者的生存时间增高(P=0.028)。而在弥漫型胃癌患者中，hMTERF1低表达胃癌患者的生存时间增高(P=0.024)。在混合型胃癌患者中，hMTERF1高表达患者与低表达患者生存时间的差异无统计学意义(P=0.310)。

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