谷子ABC转运蛋白基因与抗旱关系的研究

张瑞杰，王喆，连卜颖，郭展，魏东，于世慧，李红英,2,3*，刘晓东

(1.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801；2.农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室，山西 太原 030031；3.杂粮种质资源发掘与遗传改良山西省重点实验室，山西 太谷 030801;4.山西省农业科学院 作物科学研究所，山西 太原 030031)

谷子(Setariaitalica)，禾本科，狗尾草属，是中国传统的粮食作物，距今已有7500多年的栽培历史[1]。研究表明，谷子具有丰富的营养价值，各种成分均衡、饲草蛋白含量高，且具有很高的水分利用效率、抗旱耐瘠、适应性广等突出特点[2～4]。因此，谷子在我国农业生产中占有举足轻重的地位。在中国，谷子主要分布在北方黄河流域中上游的干旱、半干旱地区。由于地区性降水不均，大部分区域降水较少，干旱成为制约谷子品质与产量提高的主要问题[5]。因此，选育抗旱能力强，适应范围广的谷子品种是目前育种的主要方向之一。

ABC转运蛋白(ATP-binding cassette transporters)是一类跨膜蛋白，广泛存在于自然界生物体中，是目前已知最大、最古老的蛋白家族之一[6]，在植物的抗逆胁迫中发挥着重要作用。已有研究证实ABC转运蛋白广泛参与植物的抗逆反应[7]，如浮萍中的PDR基因SpTUR2受干旱、ABA、低温和盐的诱导表达[8]；拟南芥中AtABCG40基因的表达能够促进植物的抗旱能力以及对金属铅的耐受力[9]；在拟南芥中AtABCG36基因过表达可以提高植株对干旱与盐胁迫的抗性，参与植物的抗旱反应[7]；AtABCC5、AtABCG31通过调节气孔开闭，增强植物的抗逆性[10，11]；水稻中的OsABCG36基因可以对干旱、ABA等胁迫做出应答反应[8]；在高盐、干旱等逆境条件下，水稻ABCB基因家族中均有表达[12]；小麦中的TaPDR1基因参与植物抗病防御反应[13]。

目前拟南芥、水稻ABC转运蛋白的研究较多，分别有129个和128个ABC转运蛋白基因被发掘[14]，而谷子中关于ABC转运蛋白的研究相对较少，对ABC转运蛋白基因与谷子抗旱关系的研究更是微乎其微。为了更好地了解ABC转运蛋白与谷子抗旱的关系，本文根据PEG胁迫处理下的抗旱品种(GG)和干旱敏感品种(JF)的转录组数据，分析了两个品种中与干旱相关的ABC转运蛋白基因的基本信息和表达情况，并利用生物信息学方法，进一步分析了起始密码子上游1 500 bp的启动子顺式作用元件，并构建进化树比较这些基因亲缘关系的远近。初步了解谷子ABC转运蛋白基因与谷子抗旱的关系，并推测Seita.7G176000.1可能是谷子抗旱候选基因，研究结果为后续该蛋白基因的功能鉴定和研究奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

研究材料为抗旱品种勾勾母鸡咀(GG)和干旱敏感品种晋汾16(JF16)，由山西农业大学提供。将谷子幼苗置于人工气候室，14 h光照28 ℃/10 h黑暗23 ℃培养，出苗后每3天浇一次蒸馏水，培养3周后，釆用20% PEG-6000干旱处理0.5 h，用蒸馏水处理相同时间做对照，每个处理随机选取3株用于RNA提取，进行表达谱测序。

1.2 研究方法

利用Phytozome v 11.0豫谷1号基因组数据库(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)进行关键词搜索，获取谷子ABC转运蛋白基因的基本信息；利用网站http://web.expasy.org/compute_pi/在线预测蛋白质分子量和理论等电点理化性质；利用MEGA 7.0进行氨基酸序列比对，构建系统进化树；利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在线分析启动子顺式元件。

2 结果与分析

2.1 谷子ABC转运蛋白基因基本信息及理化性质分析

通过Phytozome v 11.0豫谷1号基因组数据库获取了谷子ABC转运蛋白基因信息并通过网站http://web.expasy.org/compute_pi/在线预测蛋白质分子量和理论等电点，结果如表1所示。4个ABC转运蛋白基因分布在3条不同的染色体上，分别位于1，5，7号染色体的不同位点。不同的基因其基因组序列有很大区别，最长为9 254 bp，而最小的只有3 384 bp；Seita.5G185300.1蛋白最长有1 447个氨基酸，Seita.1G086300.1蛋白最短有457个氨基酸，相对应的蛋白分子量范围在51 195.75～161 579.13Da之间，CDS序列长度在1 374～4 344 bp之间；等电点预测发现，除Seita.1G039400.1的等电点为6.81显酸性外，其他3个基因均显碱性。

表1 谷子部分ABC转运蛋白基因基本信息Table 1 Basic information of some ABC transporter protein genes in foxtail millet

使用GSDS2.0对ABC转运蛋白基因进行基因组结构绘制，结果如图1所示。除Seita.1G086300.1没有内含子以外，其他3个均含有内含子和外显子结构，其中Seita.1G039400.1内含子数目最多(Seita.1G039400.1)为18个，Seita.5G185300.1和Seita.7G176000.1都含有8个内含子；Seita.5G185300.1有较长的上游序列，而Seita.7G176000.1有较长的下游序列。

图1 谷子ABC转运蛋白基因内含子-外显子结构Fig.1 Intron-exonstructures of ABC translocation protein genes in foxtail millet

2.2 谷子ABC转运蛋白基因与其他植物ABC抗逆相关基因系统进化树分析

利用MEGA7.0对4个谷子ABC转运蛋白基因及5个其他植物ABC抗逆相关基因进行系统进化树分析，比较其亲缘关系的远近(图2)。从图2可以看出，Seita.1G039400.1和Seita.7G176000.1亲缘关系最近，其次与AtABCC5亲缘关系较近；Seita.1G086300.1与AtABCG36和AtABCG31亲缘关系较近。

2.3 谷子ABC转运蛋白基因启动子元件分析

谷子ABC基因中与干旱胁迫相关的元件主要有脱落酸响应元件ABRE、水杨酸响应元件TCA-element、热胁迫响应元件HSE、低温响应元件LTR、胁迫响应元件TC-rich repeats以及MYB元件等。以豫谷1号序列为参照，选取起始密码子上游1 500 bp序列为启动子区，利用PlantCARE在线分析这4个ABC转运蛋白基因启动子区元件。将启动子顺式元件归类，进行统计分析(表2)。结果显示，不同基因的调控元件总数不同，Seita.1G039400.1基因的顺式调控元件最多，高达75个，Seita.5G185300.1基因最少，含有51个顺式调控元件；其中只有Seita.1G086300.1基因含有ABRE调控元件，只有Seita.1G039400.1 基因含有水杨酸响应调控元件；Seita.1G039400.1 基因所含的茉莉酸甲酯响应元件最多，高达8个；此外，在这4个ABC转运蛋白基因中，启动子区均含MYB元件，MYB属于转录因子，与干旱、ABA的诱导表达有关。

图2 谷子ABC转运蛋白基因与其他植物ABC抗逆相关基因系统进化树分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of ABC translocation protein genes in foxtail millet and ABC tolerance genes in other plants

表2 谷子部分ABC蛋白基因启动子顺式元件预测Table 2 Predicted cis acting elements of partial ABC transporter protein in foxtail millet

注：以上数据不包括基本启动子元件TATA-box和CAAT-box。
Note：The data does not include the basic promoter elements such as TATA-box and CAAT-box.

图3 GG和JF16 ABC转运蛋白基因的表达水平Fig.3 Expression levels of expansin ABC transporter genes in GG and JF16

2.4 谷子ABC转运蛋白基因在干旱胁迫下的表达模式分析

用20% PEG-6000模拟干旱胁迫，处理抗旱品种勾勾母鸡咀(GG)和干旱敏感品种晋汾16(JF16)，对其ABC转运蛋白基因进行表达谱分析。

由图3可见，GG和JF16基因组中有4个基因(Seita.1G086300.1、Seita.1G039400.1、Seita.5G185300.1、Seita.7G176000.1)均表达。2个品种的Seita.1G086300.1基因在正常浇水与干旱胁迫下均有表达。正常浇水情况下，抗旱品种GG的表达量高于干旱敏感品种JF16；干旱胁迫下，这两个品种的表达量均下调，且GG下调幅度较JF16高。正常浇水情况下，干旱敏感品种JF16的Seita.1G039400.1的表达量高于抗旱品种GG；干旱胁迫下，2个品种的Seita.1G039400.1的表达量均下调，且JF16下调幅度较GG高。在干旱胁迫下，Seita.5G185300.1基因在抗旱品种GG中不表达，但在正常浇水情况下表达水平上调；JF16的Seita.5G185300.1基因在正常浇水与干旱胁迫下都表达，且无明显差异。JF16的Seita.7G176000.1 基因在正常生长条件下表达水平较GG高；在干旱胁迫后表达水平都上调，且GG上调幅度较JF16高。

3 结论与讨论

干旱严重影响着作物的品质与产量[5]，谷子作为抗旱作物，研究其抗旱机理对于选育抗旱新品种具有重要的意义。本文通过对谷子中ABC转运蛋白基因进行生物信息学分析以及表达谱分析，初步探讨ABC转运蛋白基因与谷子抗旱的关系。

ABC转运蛋白是植物中重要的抗逆蛋白。通过分析谷子中编码ABC转运蛋白的基因序列，发现其启动子序列中含有许多抗逆相关的元件，如脱落酸响应元件ABRE、水杨酸响应元件TCA-element、热胁迫响应元件HSE、低温响应元件LTR、胁迫响应元件TC-rich repeats以及MYB元件等。谷子具有抗旱耐瘠的特性，结合实际情况，推测其可能参与谷子抗旱调节。

ABRE是ABA合成时所需要的相关元件，ABA与抗旱息息相关。试验发现Seita.1G086300.1含有的ABRE元件最多，另外，系统进化树表明Seita.1G086300.1基因与AtABCG36和AtABCG31亲缘关系较近，已有研究表明在拟南芥中AtABCG36基因的过表达可以提高植株对干旱与盐胁迫的抵抗能力，参与植物的生物胁迫[7]。但是在表达谱分析中，抗旱品种GG在20%PEG处理后Seita.1G086300.1表达量下降，与启动子分析结果以及系统进化树结果不一致。这可能是因为该基因上游含有其他负调控转录因子，使得GG在干旱胁迫处理中Seita.1G086300.1基因表达量下降，有待进一步证实。20%PEG胁迫下(同正常浇水相比)，Seita.7G176000.1 基因在抗旱品种GG中表达水平的上调幅度显著大于干旱敏感品种JF16，系统进化树中，Seita.7G176000.1 基因与AtABCC5亲缘关系较近。这可能是由于抗旱品种中Seita.7G176000.1基因的高水平表达，促使植物调节气孔开闭，提高对干旱的抵抗能力，该结果与赵胡等人的研究结果是一致的[10]。

综上所述，本研究通过对谷子ABC转运蛋白基因进行生物信息学分析，并分析干旱处理下其表达情况，初步了解ABC转运蛋白基因与谷子抗旱的关系，并推测Seita.7G176000.1 ABC转运蛋白基因可能为谷子抗旱候选基因，研究结果为进一步探究ABC转运蛋白基因在谷子响应干旱胁迫过程中的作用提供依据。

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