水生生物环境DNA检测技术及其应用

吴昀晟 ，唐永凯 ,2，李建林 ,2，刘凯 ,2，李红霞 ,2，王钦 ，俞菊华 ,2

（1.南京农业大学无锡渔业学院，江苏 无锡 214128；

2.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，江苏 无锡 214128）

随着我国经济建设的快速发展，水体污染、水利工程建设、养殖业剧增等因素对水生生物的产卵场、索饵场、越冬场、洄游通道等生境带来了许多不良的影响，导致了生物资源量急剧下降和生态环境严重恶化。为缓解这一现状，目前已着手建立自然保护区、制定各项保护政策。在诸多措施实施之前，急需对水生生物资源进行全面的调查，但水生生物隐蔽性强，生长形态多变，生境复杂多样等，难以观测鉴定，给水生生物的保护和救治带来了巨大的困难[1-4]。传统的水生生物监测方法依靠观测者对物种鉴定的形态学知识，通过肉眼观测、人工计数进行实地调查，不但调查结果不全面，而且工作量大，调查成本高[5]。拖网、围网、电捕鱼等传统的监测手段有时会给水生生物或水生生态系统带来一定程度上的侵入性影响[6,7]。海底拖网会持久影响底栖生物的栖息地，甚至伤害或杀死非目标生物，降低海底结构的生物多样性[8]。保护水生生物资源及生态系统多样性需要掌握不同生态系统多样性的现状、变化规律及趋势，亟需一种经济、高效、准确、灵敏且不损伤目标物种的监测方法。

近年来，环境 DNA（environmental DNA，eDNA）检测技术发展迅速，已引入水生生物资源调查领域，广泛应用于入侵物种的早期监测、濒危物种的分布监测、寄生虫疾病的监测和生物量评估等。只要生物生存在水环境中就可以检测到它的存在，评估其相对数量。因此该技术的成熟完善有望弥补传统水生生物监测方法的不足，为水生生物资源调查提供新的视野与思路。

1 eDNA检测技术

生存于环境中的生物与环境相互作用，不断将含有自身遗传信息的细胞组织释放到环境中，例如排出尿液与粪便、分泌唾液、脱落毛发皮肤、受伤出血和尸体分解等[9-11]。eDNA是指从这些调查物种生存的环境样本（如土壤、水、空气等）中直接提取总DNA，其中包含活细胞组织的胞内DNA和细胞组织死亡后膜降解、细胞结构破坏而释放到环境中的胞外DNA，是不同生物完整的基因组DNA与其降解后DNA片段的混合物[12,13]。eDNA检测技术是指利用各种检测手段识别eDNA中关于目标物种的信息，监测已知生物在环境中的分布情况，探寻环境中的未知生物[14]。

水生生物eDNA检测技术主要分为：环境水样的采集与保存、eDNA的提取与分析及结果分析三个部分。根据目标生物生理状况、种群密度及水体环境，选取适当的采样范围、采样水层、采样次数及重复数，有助于提高目标生物的检测率。Shaw等[15]指出，每个采样点的重复数与检测率有很高的相关性，重复数从2个增加到5个，检测率明显升高达到100%。采集的水样应在冷藏或冷冻保存24h内抽滤或沉淀处理[16]。选择适当的滤纸（硝酸纤维膜、混合纤维膜、玻璃纤维膜、聚碳酸酯膜等），采用合理的保存方式（乙醇或冷冻等）和有效的eDNA提取方法（酚氯仿法或各种试剂盒）以最大限度地回收水样中的eDNA[17]，更真实地反映目标生物在环境中的存在情况。

在调查物种的目标基因选择上，通常倾向于线粒体、叶绿体或rRNA基因中大于500bp的DNA序列，如动物线粒体中细胞色素氧化酶I基因（COI）、植物的核酮糖1,5-二磷酸羧化酶基因（rbcL）与成熟酶K基因（matK）、真菌的内转录间隔基因（ITS）等[18-20]。这些基因在每个细胞中的拷贝数高，特异性更灵敏。数字液滴PCR、实时荧光定量PCR等检测技术的发展，促使eDNA检测技术操作更加标准简易，执行更加经济实惠，检测结果更加稳定可靠[21]。

2 水生生物eDNA检测技术的应用

eDNA的应用研究最早可以追溯到1987年。Ogram等[22]通过梯度离心和层析直接从海洋底泥的沉积物中获得了大量DNA。2000年，Rondon等[23]在土壤微生物研究中首次明确提出eDNA的概念，并迅速为广大研究者接受。2005年，Martellini等[24]从环境中采集水样提取DNA，寻找地表水的污染源，此技术开始应用于水生生态系统的研究。2008年，Ficetola等[25]利用特异性引物扩增水样eDNA中的目的片段来检测、追踪入侵物种美国牛蛙Rana catesbeiana。eDNA技术可靠地检测到环境中那些不能直接观察的隐匿物种，开辟了水生生物实时监测和保护的新视野。经过多年的研究，eDNA技术检测的水样可以来源于沉积物[22]、冰川冻土[26]、河流[27]、池塘[25]、海洋[28]、人工水箱[29]等；水生环境中的监测生物从鱼类拓展到两栖类[29]、哺乳类[30]、爬行类[31]乃至昆虫[32]等；监测的物种数量从单一物种到数个物种，再到同时检测多个物种。

2.1 入侵生物的监测应用

外来生物或传播疾病，或与本土生物竞争食物[33]，影响物种种类和数量，破坏生态系统平衡，这也是造成全球生物多样性丧失的主要原因之一。生物入侵的早期监测是控制种群数量与入侵范围，降低有害影响并最终消除这些生物的关键。但传统监测方法不但耗时耗力、且极易低估入侵程度，而eDNA检测技术在检测低密度生物时仍有很高的成功率和准确度。2013年，Jerde等[34]用eDNA检测技术监测亚洲鲤入侵密歇根湖、伊利湖等北美五大湖的情况时，发现鳙Aristichthys nobilis和鲢Hypophthalmichthys molitrix的入侵范围已经超出了传统监测方法划定的监管区域，这表明eDNA检测技术在入侵物种的精准定位方面具有传统生物调查方法无可取代的优势。

2.2 濒危生物的监测应用

保护濒危生物，首先需要了解该生物的栖息地分布，而eDNA检测技术提供了一种简易可靠的方法[35]。Rees等[36]比较了eDNA检测技术与传统的调查方法调查濒危动物冠北螈Triturus cristatus的分布。结果表明，从发现有冠北螈的地区采集到的水样中检测出含有冠北螈DNA的概率为84%，且两者的kappa系数为0.86，eDNA检测技术与实地调查结果完全一致，这表明eDNA检测技术检测濒危物种是可靠和准确的。在调查洄游性鱼类的栖息地和洄游时期时，传统的监测方法非常困难，而eDNA检测技术则可以达到这一目标。Yamanaka等[37]利用该技术准确跟踪调查了日本花鲈Lateolabrax japonicus、鲻 Mugil cephalus、香鱼 Plecoglossus altivelis 三种季节性洄游鱼类的洄游路径，丰富了鱼类的洄游模式，分析了河海之间的三座人工大坝是否影响鱼类栖息地的连通性。Stewart等[38]利用eDNA检测技术监测天鹅湖中的长江江豚Neophocaena phocaenoides asaeorientalis，发现深层水样中的eDNA更能反映真实情况，而且在哺乳期、繁殖期等生殖活动频的时期，被检测到的eDNA的概率明显增加。因此，eDNA不但反映水生生物的生物量，也可监测生物的生理活动。

2.3 寄生虫疾病的监测应用

水生生物的保护不仅局限于资源调查和栖息地保护，还包含繁育、检疫、疾病防治、经营管理等诸多方面。多数水生生物常患寄生虫病，其中真核寄生虫体型小，遗传多样性强，生理形态模糊，生活史复杂，宿主广泛，难以定位并研究相关病理。Huver等[39]分析比对了eDNA技术与尸检方法检测吸虫Ribeiroia ondatrae，指出eDNA检测技术检测寄生虫的准确性和灵敏性很高，可以检测到低至14 fg的DNA含量，并进一步地评估了寄生虫的整个生命周期是否一直保持寄生状态以及寄生虫在适当环境下感染其他潜在宿主的可能性。Gomes等[40]研究指出，水中原生寄生虫Chilodonella hexasticha eDNA的水平变化与随后鱼类死亡具有高度相关性，强调了eDNA检测技术在快速评估水中寄生虫负荷、预测寄生病爆发的潜力，为水生生物疫情的预防提供了可靠的工具。但寄生虫囊泡和卵鞘具有很强的物理抗性[41]，需要强大的力量才能破裂释放DNA，很可能造成错误的评估。

2.4 生物量评估的应用

水生生物生物量的评估一直是传统调查的难点，特别是评估活动性强的水生动物。2012年，Thomsen等[28]首次尝试利用eDNA检测技术评估海洋环境中某一物种的生物量。该技术在水生生物检测的应用从定性到相对定量，并开始向绝对定量拓展。Takahara等[42]在实验室水箱和人工池塘里模拟野外环境，探索鲤数量和水中eDNA之间的关系，证明了eDNA浓度与鲤密度呈正相关关系，建立了线性方程。Pilliod等[43]同样在野外试验中证明了eDNA浓度与实测密度、生物量和占用断面的比例呈正相关性。水环境中eDNA受多重因素的影响，Barnes等[29]发现池塘中鲤eDNA检出浓度遵循指数衰减模式，其降解速率随生化需氧量、叶绿素和总eDNA浓度增加而下降。Buxton等[44]比较了不同基质对水样中eDNA的影响，结果显示均能检测到冠北螈的DNA，沙子、粘土、表层土三种基质与对照组的检测率无显著差异，10d后检测率为40%～60%，15d后检测率为10%～22%，22d后检测率下降到非常低的水平。而Giguet-Covex等[45]发现在冻土沉积物中，eDNA可以保存几百甚至几千年。因此，为了提高eDNA评估生物量的准确性，必须阐明eDNA产生和降解的动力学机制并量化温度、pH、叶绿素、生化需氧量、光照强度、水体、微生物群体等环境因子对eDNA的影响[46]。

3 水生生物eDNA检测技术的优势与挑战

水生生物的监测与保护是一项长期性的工作，监测的成本、效率和有效性都至关重要。eDNA检测技术通过制定标准化的应用流程可以降低工作量，缩减人工成本和调查成本。在取样过程中，只采集栖息地的环境样品，不与目标生物直接接触，避免破坏本已脆弱的生境，减少对调查物种的影响，使调查无创伤性。传统的监测方法在某些特定的季节、天气、环境里实施非常困难，而eDNA检测技术受自然因素影响相对较小，这不但保证了长期调查的持续性，还拓展了调查的环境范围；同时对两种甚至更多的目标生物调查并研究其分布，有助于分析物种之间的关系和群落多样性的动态。Foote等[47]在探测海洋哺乳动物时，用静态声学监测技术识别定位鼠海豚Phocoena phocoena的同时，应用eDNA检测技术发现了罕见的长肢领航鲸Globicephala melas。因此eDNA检测技术是对传统监测调查结果的印证与补充而不是取代，两者协同开展不会互相干扰。

eDNA检测技术在应用过程中也会遇到许多挑战。Deiner等[48]指出，eDNA可以沿着河流漂流超过10km，也可以通过船舶或捕食者粪便出现在没有目标生物出没的地区，此时选择合理的采样地点以及持续性的监测可以有效规避此类原因所带来的误报。样品在采集、运输和保存过程中都可能发生污染。因此在调查前必须对采样工具、设备进行严格的灭菌处理；每个采样点增加阴性对照即过滤蒸馏水或无目标生物生存区域的水样；每个采样点的样品隔离保存，防止交叉污染。在eDNA分析阶段，容易产生假阴性或假阳性扩增的结果。PCR引物和探针特异性低，环境中的PCR抑制剂或未充分提取eDNA都会导致假阴性扩增，而引物二聚物、样品污染则会导致假阳性扩增，因此在检测过程中必须要增加阴性和阳性对照[42,49]。

4 水生生物eDNA检测技术的展望

随着第二代测序技术（Next generation sequencing，NGS）的迅速发展，Pompanon 等[50]提出了一种全新的DNA条形码-DNA宏条形码（DNA metabarcoding），并将其运用于水生生物监测上。通过建立物种信息库和DNA条形码标准数据库，设计合理的通用引物对环境样品中的DNA进行扩增和高通量测序，再从测序结果中得到的可操纵分类单元（operational taxonomic units，OTUs）进行多个物种的鉴定。这种高效率、低成本、快速可重复的DNA条形码技术将更适合于复杂生态系统的水生生物鉴定及多样性评估，对物种种群的单标记分析向整个生态系统的宏基因组分析转移，构建动植物乃至微生物的物质能量传递的生态系统图谱，从生态系统水平探索生物多样性、生态系统稳定性和系统发育多样性。

经过十几年的发展，eDNA检测技术已具备了标准化的技术流程、稳定协同的调查过程和可靠动态的调查结果等优势，不仅可检测常规的水生生物，还可以检测入侵物种、濒危物种、隐匿物种等。尝试将eDNA检测技术应用于水生生物的群体遗传学中，探寻群体遗传结构及其变化，例如应用于谱系生物地理学，从遗传水平上揭露水生生物保护的关键区域，为濒危水生生物迁地保护提供理论基础。今后的水生生物资源调查研究中，在保护区深处或荒凉偏远地区建立自动取样分析站，最大程度降低人为干扰并获取水生生物监测与环境数据，结合实时数据传输技术，建立一个生物多样性监测网络，调查水生生物多样性的现状、变化规律和发展趋势。