氟诱导成釉细胞自噬上调的机制

敬 珮，管晓燕，王 倩，顾 瑜，胡 欢，肖琳琳，刘建国2，

(1.遵义医学院附属口腔医院 正畸二组， 贵州 遵义 563099，；2.遵义医学院口腔医学院 口腔内科学教研室，贵州 遵义 563099，；3.贵州省普通高等学校口腔疾病研究特色重点实验室暨遵义市口腔疾病研究重点实验室，贵州 遵义 563006)

地方性氟中毒，是一种环境化学性地方病，危害全身，主要侵犯人体的牙齿和骨骼，造成氟斑牙和氟骨症， 分布地区广，患病人数多且集中，是我国当前危害最严重的地方病。氟中毒(fluorosis)大部分是由于生活中饮用水质氟含量超标导致体内氟积蓄过多侵害人体骨骼和牙齿，引起以氟斑牙、氟骨症为主要特征的一种慢性全身性疾病，少部分人还可通过食物和空气途径引起该病。氟斑牙又称氟牙症(dental fluorosis)或斑釉牙(mottled enamel)，是人体牙在发育矿化时期摄入过量的氟，损害了处于釉质矿化期的成釉细胞所引起的釉质矿化不全，是氟中毒最早出现的、最直观的特异性表现。造成氟斑牙的具体机制尚不明确， 有推测认为是由成釉细胞出现内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)导致的细胞蛋白表达错误及细胞凋亡引起的[1]。研究表明在氟作用于成釉细胞的过程中，自噬水平也相应上身，自噬是细胞在遭受外界刺激下自身启动的保护机制，现就氟诱导成釉细胞自噬上调的机制综述如下。

1 氟斑牙

氟斑牙在世界各地均有发生，而我国氟斑牙患病者最为普及，宁夏回族自治区、内蒙古自治区、陕西、山西、甘肃、河北、山东、贵州和福建等地都有慢性氟中毒区，贵州更是氟斑牙大省。

牙齿的釉质发育矿化过程复杂且每一步都紧密相联。成釉细胞在早期合成和分泌牙釉质基质，而在后期则会对这些基质重吸收和降解以完成牙齿的矿化，是牙釉质形成最重要的细胞。釉质基质在粗面内质网中被合成，在高尔基复合体中修饰加工，再通过Tome突内的管网结构分泌出去，分泌的釉质基质的量很大程度上影响将来发育完成的釉质层的厚度。氟斑牙在形成初期蛋白分泌减少，釉质基质不足，后期蛋白水解酶分泌量不足，釉基质蛋白含量过多，釉柱晶体的生长受到干扰，无法形成正常釉质结构及厚度，也不能正常矿化，最终形成了氟斑牙。

2 自噬

自噬是细胞在遭受饥饿、氧化应激、毒性物质等情况下，与溶酶体结合后降解自身受损的细胞器或表达错误的大分子蛋白物质，再提供给细胞新蛋白质及能量的过程，有循环再利用进行细胞的物质更新、维护细胞内环境稳定和物质回收再利用帮助细胞生存等功能。自噬被首次发现是1962年Ashford和Porten在肝细胞中观察到，随后在酵母中发现了自噬的分子机制，近年来，哺乳动物的自噬的相关基因及具体发生机制已经日益清楚[2]，也了解到自噬在神经退行性变、代谢性疾病、衰老及肿瘤等疾病发生发展中的重要作用[3]。自噬分为巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)及分子伴侣介导性自噬(chaperon-mediated autophagy,CMA)。①巨自噬：是在细胞收到外界刺激后如饥饿、缺氧、素等，出现来源不明的单层膜凹陷形成杯状双层膜结构，被称为自噬泡，其膜不断延伸包裹受损细胞器、错误蛋白质或一些其他多余大分子物质，最后逐渐封闭形成自噬小体，再通过微管运输到溶酶体，自噬体外层膜与溶酶体膜融合，形成自噬溶酶体，之后内膜被溶酶体溶解，其内容物在溶酶体内被降解。巨自噬相较于其他两种自噬最为普遍，通常所说的自噬也就是巨自噬，对促进细胞存活、维持细胞内稳态和更新物质提供能量等起着非常重要的作用。②微自噬：又称小自噬，当细胞遇到饥饿时，溶酶体局部凹陷包裹微体、衰老蛋白质等，然后与溶酶体膜分离，单独形成自噬小体，被运送到溶酶体腔内被溶解。微自噬在细胞内发生很少，主要功能就是在细胞遭受饥饿时通过自噬清除多余的大分子、降解衰老蛋白，为细胞提供新的物质和能量，维持细胞生命状态。③分子伴侣介导性自噬：1998年，由Cuervo和Dice首次提出分子伴侣介导性自噬的概念[4]。不同于巨自噬与微自噬，分子伴侣介导性自噬是错误折叠的蛋白质与分子伴侣结合，通过特异性识别溶酶体膜上的受体，使蛋白质进入溶酶体内进行降解。蛋白质上的特定氨基酸序列与分子伴侣Hsc70特异性结合后，所形成的复合体与溶酶体上的受体Lamp2α(Lysosome-associated membrane protein 2α)结合，再由溶酶体内的另外一种分子伴侣介导进入溶酶体腔内完成物质的降解。

3 内质网应激与自噬

细胞中内质网是蛋白质合成、修饰、运输的重要场所,同时还是钙的储存库，在调节细胞内平衡及诱导细胞凋亡方面具有重要作用。在内质网中，蛋白质被折叠并修饰成最终具有功能活性的蛋白质，该类蛋白质会被转运到高尔基体，而没有活性的蛋白质则继续在内质网中完成折叠与修饰，或者进入内质网降解途径(ER-associated degradation,ERAD)，通过泛素-蛋白酶体系统降解[5]。当内质网腔内平衡被破坏时,内质网功能将发生紊乱,产生大量未折叠蛋白或错误蛋白并不能被有效降解，废用物质在内质网腔内大量的堆聚，并且产生钙离子浓度异常，导致内质网应激。

成釉细胞在过量氟化物刺激下产生内质网应激[6]，蛋白分泌减少、釉质基质不足和釉质结构异常。并且成熟期成釉细胞分泌多种蛋白水解酶，如果此时细胞发生内质网应激，可导致酶蛋白合成错误，相关酶分泌量减少，釉基质蛋白无法被水解而堆积，基质含水量增多，釉柱晶体的生长受到干扰，无法形成正常釉质结构及厚度，不能正常矿化[1]。而自噬作为一个高度保守的保护性机制，当内质网应激造成错误蛋白潴留，细胞凋亡的时候，细胞上调自噬表达水平，启动保护机制。从酵母细胞到哺乳动物，细胞中都存在自噬与内质网应激之间的高度保守的相互调控[7]。Jacinto-Alema等[8]证明，过量的氟化钠诱导成釉细胞发生应激反应。Sierant 等[9]研究表明，氟在诱导成釉细胞凋亡时都同时发现了氧化应激反应及内质网应激反应的参与。雷双等[10]研究显示，当对成釉细胞给予过量氟干预会造成细胞自噬水平上升。

3.1 未折叠蛋白反应与自噬 细胞在出现内质网应激时,为缓解内质网应激状态,在其发生的早期可通过内质网与细胞核之间的信息传递通路,调节内质网伴侣蛋白的表达,减少错误折叠蛋白和未折叠蛋白积聚,以恢复其功能和稳态,这一过程称为未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)[1]。在UPR的三条未折叠蛋白反应信号传导通路均被证实在内质网应激时与细胞自噬存在相关性。葡萄糖调节蛋白78(glucose regulaing protein 78,GRP78)又称为免疫球蛋白重链结合蛋白能够及时反映内质网中错误蛋白质的堆积以及内质网应激中分子的变化。在无内质网应激时，蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like ER kinase,PERK)、肌醇需求酶1(inositol repuiring enzyme 1,IRE1)、转录激活因子6(activating transcription factor 6,ATF6)均分别与GRP78结合，无活性，当发生内质网应激时，GRP78与PERK、ATF6、IRE1发生解离而与更具有亲和力的未折叠蛋白质结合，释放UPR传感器,激活UPR，允许UPR信号跨过ER 膜激活和转导到细胞质和细胞核[11]，从而启动对细胞的保护作用。GRP78对内质网行使正常功能和内质网应激诱导自噬发生非常重要，抑制GRP78后，内质网失去正常功能，虽然UPR、LC3仍然会被激活，但内质网诱导的自噬体无法形成[12]。张凯强等[13]发现对大鼠成釉细胞给以不同浓度的氟化物时，内质网伴侣分子 GPR-78、XBP-1、caspase-12 等的表达量随着氟化物浓度的升高而增高。

IRE1活化后，其激酶活性域通过促细胞凋亡信号调节激酶(ASK1)和分裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAPKKK)招募肿瘤坏死因子受体相关因子2(tumor necrosis factor receptor-associated factor 2 ,TRAF-2)，在TRAF-2的作用下激活c_Jun氨基末端激酶(JNK)途径[14]，JNK迅速磷酸化Bcl2，使其与Beclin_1分离[15]，从而激活PI3K激酶途径，从内质网中释放与III型磷酸肌醇3激酶/泡膜蛋白34 ( PI3K/Vps34) 、Vps15 及 Atg14 组成 Beclin1 复合体促进自噬柄成核、延伸形成自噬体[16]，进而调节自噬下游。还有研究表明，IRE1可以通过增加X盒结合蛋白1基因(Xbp-1)的转录来诱导自噬，在扇贝毒素引起内质网应激时，IRE1-XBP1路径提高BNIP3基因的转录，而BNIP3抑制RHEB的表达从而抑制雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路，产生自噬上调[17]。Kaori Kubota等[18]用高剂量氟刺激小鼠成釉细胞系，发现了内质网应激、生长停滞和DNA损伤、诱导蛋白(GADD153/CHOP,GADD45α)、结合蛋白(BiP)、GRP78、非分泌形式的碳酸酐酶VI(CA-VI)及Xbp-1在暴露于38ppm氟化物之后都被显著诱导，且还发现成釉细胞对大剂量氟化物的毒性作用是由敏感并且活化的IRE1引发内质网应激反应所致。

其次，PERK活化会通过eIF2α_ATF4_CHOP信号通路来调节自噬。首先活化的PERK酸化eIF2α，促进ATF4的表达升高，ATF4的升高使得CHOP增加了mTORC1抑制物TRB3的表达量，mTORC1被抑制从而上调自噬。PERK_eIF2α_ATF4通路还能上调ATG12，促进LC3I向LC3II转化，诱发细胞自噬。同时活化的PERK会阻断NF_IkB的翻译从而激活NF_IkB，进而调节自噬[19]。有研究表明，在丙肝病毒感染产生的内质网应激时，ATF6通过连接DNA损伤诱导转录物3链和LC3II基因点253-99基础启动子区，使LC3II蛋白表达量增加，以上调自噬[20]。

3.2 Ca2+与自噬 马林等[21]报道,随着干预成釉细胞氟含量浓度的增加，细胞内Ca2+浓度也随之增加。有研究证明，内质网稳态失衡导致胞内钙离子浓度升高，会抑制mTOR通路，诱导细胞产生自噬。在内质网应激时，释放腔内的Ca2+到内质网外，以激活细胞内自噬途径中的一些激酶和蛋白酶信号[21-22]。通过使用RNA阻断剂和抑制剂证实，Ca2+依赖的自噬发生时，可以通过激活钙及钙调蛋白依赖激酶-β(calmoldulin dependent kinase-β,CAMKK-β)介导的5’_磷酸腺苷激活蛋白激酶(AMP_activated protein kinase,AMPK)活化，进一步抑制mTOR，上调细胞自噬，有研究表明肝细胞的内质网应激可通过AMPK_mTORC1通路诱发细胞自噬[23]。

死亡相关蛋白激酶和calpain蛋白酶这两个钙依赖酶在细胞内的Ca2+浓度的增加会被激活，参与自噬反应的调节[24]。calpain-4基因敲除的小鼠MEFs，即使用各种自噬相关因子刺激也无法形成自噬小体，细胞内堆积蛋白质也没有被明显的降解。人类的骨肉瘤细胞缺失calpain-4后，在细胞内检测到大量表达的LC3-I和LC3-II，但它们只是蓄积在核内体小泡中，并不能被附着到细胞膜上或者已经黏附的LC3不能够成熟，以致不能激活自噬的发生。

4 展望

Min Wei等[25]证明了氟化物诱导MC3T3-E1细胞凋亡以及自噬，加入RAPA自噬诱导剂后，细胞凋亡率随之下降，表明诱导的自噬可保护MC3T3-E1细胞抵抗氟诱导的细胞凋亡。细胞为适应各种刺激压力激活自噬为其主要保护途径，大量的实验研究表明，通过恢复自噬通量和抑制凋亡，许多毒物所致的肾损伤可以通过药理学试剂如海藻糖、二甲双胍和雷帕霉素及大黄素显著缓解[26-29]。研究表明，铅(II)促进在RPT细胞自噬体的形成，并且增强自噬体的形成可以抑制细胞凋亡，从而减轻铅对RPT细胞的毒性伤害[30-32]；自噬能减弱缺血/再灌注损伤后的神经元细胞损伤[33]和镉诱导的近端小管损伤[29]，营养缺乏或生长因子不足诱导细胞中的自噬能通过抑制细胞凋亡帮助细胞存活等。自噬也保护细胞免受各种其他凋亡刺激[33]。

过量氟对成釉细胞的具体损害机制虽然还未十分明确，但目前认为主要跟内质网应激及Ca2+通道有关，产生一系列反应导致釉质矿化不全，诱导自噬水平上调，自噬有可能对成釉细胞产生一定的保护作用，但自噬的保护反应的具体机制不明确，最终为何会产生氟斑牙，是否因为自噬表达水平无法代偿长期的过量氟摄入产生的损害？尚需更多研究探究与证实，相信在不久的将来一定可以明确具体机制并找到防治氟中毒的有效方法。