内质网应激与心力衰竭的相关性研究进展

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心力衰竭(heart failure，HF)是由于心脏结构和功能异常而导致心室充盈障碍或射血减少的复杂临床综合征，是各种心血管疾病晚期共有的终末器官损害，正在成为21世纪最重要的心血管病症。对心力衰竭机制的研究一直是心血管领域的研究热点。以往的研究提出了多种机制，包括：β-肾上腺素能受体信号传导脱敏，心肌细胞兴奋-收缩耦连调节异常，细胞骨架蛋白、肌球蛋白同种型开关和能量利用功能障碍导致心肌细胞收缩功能丧失[1]，以及炎症介导的心肌细胞损伤等[2]。越来越多的研究证实心肌细胞凋亡引起心脏可逆的收缩功能障碍，可介导心力衰竭的起始、维持和进展，在心力衰竭中起关键作用[3]。心肌细胞是一种终末分化细胞，若心肌细胞不断死亡丢失，则意味着心脏泵血功能的下降，即导致心力衰竭的发生、发展，从代偿走向失代偿的转折点[4]。

目前认为参与细胞凋亡的途径有3条：外源性死亡受体途径、内源性线粒体途径和内源性内质网途径[5]。近年来，内质网途径的细胞凋亡越来越受到重视[1]。内质网是细胞中具有重要生理功能的细胞器，可参与蛋白质合成与修饰、类固醇物质的代谢及细胞内Ca2+的调节。同时内质网又是细胞应对缺血缺氧等损伤的首要细胞器，其正常稳态的破坏引发内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，ERS常早于并可进一步诱导基因转录水平上的核反应和代谢水平上的线粒体反应[6]，过度的ERS最终导致细胞凋亡并参与不同疾病的发生发展[5]。

1 内质网应激

1.1 未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR) 细胞应激导致内质网中未/错误折叠蛋白聚集，引发内质网稳态失衡，导致一种高度保守的内质网应激反应，即未折叠蛋白反应，抑制内质网中的蛋白合成，增强受损或错误折叠蛋白的降解，并在转录水平选择性诱导保护性蛋白的表达，增强内质网的蛋白折叠能力，调节内质网蛋白合成稳态[5]。

此过程由3种内质网跨膜受体蛋白介导：蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like ER kinase，PERK)、肌醇需要酶(inositol requiring kinase 1，IRE1)和活化转录因子6(activating transcription factor 6，ATF6)。在正常的无应激细胞中，三者在内质网腔内侧与葡萄糖调节蛋白78(Glucose-regulated protein 78/Binding protein，GRP78/Bip)结合而处于无活性状态。内质网内未/错误折叠蛋白的聚集使GRP78从这3种蛋白解离与未/错误折叠蛋白结合以协助其正确折叠。GRP78的解离使PERK、IRE1和ATF6活化，进而触发UPR反应信号转导的下游反应。

PERK通过寡聚化和磷酸化激活，磷酸化真核细胞翻译起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2，elF2α)，使eIF2不能再被重复利用，造成真核细胞蛋白质翻译启动和合成降低，新蛋白合成减少，以减轻内质网负荷。PERK激活和eIF2磷酸化最终导致：内质网中蛋白质折叠负担降低；诱导eIF2磷酸化依赖性ERS基因的表达；促进细胞存活[5]。

IRE1是含有位点特异的RNA内切酶活性的Ser/Thr受体蛋白激酶，受GRP78负调节。内质网内异常和未折叠的蛋白质积累引起GRP78从IRE1解离，使IRE1发生寡聚化和磷酸化激活，从而触发其RNA内切酶活性[7]。IRE1切割X-盒结合蛋白-1(X-box binding protein 1，XBP1)mRNA前体，切除26bp的序列，导致翻译移码，产生54 kD大小的加工后XBP1蛋白，结合内质网应激反应元件(endoplasmic reticulum stress element，ERSE)的启动子区，上调ERS相关基因转录以增强内质网功能，有助于挽救受损的细胞[8]。IRE1信号可影响UPR期间的细胞命运。ERS初始阶段，IRE1信号途径激活，产生细胞保护作用；持续的ERS使IRE1活性减弱，细胞凋亡途径激活，诱发细胞凋亡[9]。定位在线粒体相关内质网膜(mitochondrion-associated ER membrane，MAM)的Sigma-1受体(sigma-1 receptor，Sig-1R)可以调节IRE1活性。当细胞处于ERS时，Sig-1R从GRP78解离，直接且优先地通过MAM与IRE1的单体形式结合，防止IRE1经蛋白酶体降解，通过增强IRE1稳定性减弱ERS损伤。另外，线粒体来源的氧化应激会通过Sig-1R-IRE1-XBP1信号传导通路经MAM传递到细胞核，在细胞生存中发挥重要作用。而且，Sig-1R的过度表达可以抑制ERS诱导的PERK和ATF6的激活[10]，在应激细胞的存活中发挥重要作用。

ATF6是内质网跨膜转录因子，属于碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper，b ZIP)转录因子家族。正常情况下，ATF6存在于内质网膜，其内质网腔区的结构域与GRP78结合；在应激条件下，ATF6从GRP78解离出来[11]。从GRP78解离后，ATF6进入外壳蛋白复合物Ⅱ(coat protein complex Ⅱ，COPⅡ)囊泡，并靶向转运到高尔基体，在那里ATF6被位点-1蛋白酶(Site-1 protease，S1P)和位点-2蛋白酶(Site-2 protease，S2P)切割，水解释放其氨基末端部分，并迁移至细胞核，通过结合UPR应答基因启动子中的ERSE并触发ERS诱导的靶基因(如XBP1)及蛋白质折叠所需要的各种酶类的表达[12-13]。

1.2 内质网凋亡通路 尽管UPR主要是促生存反应，但在持久或严重ERS未能解除，内质网稳态不能重建的情况下，细胞以UPR依赖性或非依赖性方式开始凋亡[9]。目前已经明确的内质网凋亡通路有三条。

1.2.1 CHOP/GADD153基因的激活转录通路 转录因子CCAAT增强子结合蛋白(C/EBP)同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)，又称生长停滞及DNA损伤诱导基因(growth arrestand DNA damage inducible gene 153，GADD153)，在正常生理状态下基本检测不到，但在ERS时，被显著诱导表达。该通路通过下调Bcl-2表达、耗竭谷胱甘肽、促进活性氧产生等导致细胞凋亡，以清除无法恢复正常功能的受损细胞。研究证实UPR中主要转录因子ATF4，ATF6和XBP-1等都可以结合CHOP基因启动子位点，诱导CHOP基因的转录。在主动脉弓缩窄(transverse aortic constriction，TAC)模型小鼠中，术后4周心脏组织TUNEL检测(transferase-mediated dUTP nick-end labeling，端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记)发现，TUNEL阳性的凋亡心肌细胞数量显著增加，同时CHOP被显著诱导表达，说明CHOP在主动脉缩窄模型小鼠的心肌细胞凋亡中起着重要作用[14]。

1.2.2 JNK的激活通路 c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)又称为应激活化蛋白激酶(stress-activated protein kinase，SAPK)，是丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated-protein-kinases，MAPK)家族的一员。在应激状态下，IRE1激活，募集衔接分子肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)受体相关因子2(TNF receptor-associated factor 2，TRAF2)和凋亡信号调节激酶1(apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1)，然后形成IRE1-JNK-TRAF2-ASK1复合物，使ASK1激酶活化，并导致JNK促凋亡信号转导通路的活化，将信号传递给胞核内的组分，最终通过核转录因子来调控细胞的表达[15]。面对过度的ERS，通过激活包括p38MAPK，JNK和IKK(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase)的几种激酶引发报警阶段，随后导致核转录因子kappa B(nuclear factor kappa B，NF-κB)核易位，最终上调促凋亡转录因子CHOP以及在啮齿动物中半胱氨酸蛋白酶-12(cysteine-aspartic acid protease-12，caspase-12)水解裂解，诱导细胞凋亡。

1.2.3 Caspase-12的激活通路 Caspase-12存在于内质网膜上，只被ERS所活化。胞浆中Ca2+浓度升高导致钙蛋白酶激活并转移到内质网膜，钙蛋白酶切割procaspase-12使其活化成caspase-12[16]。活化的caspase-12可以启动正反馈回路，通过激活caspase-9，导致下游caspase-3的活化，引发一系列级联反应诱导细胞凋亡[5，17]。除了通过caspase-3引发细胞凋亡外，活化的caspase-12易位于细胞核，可直接引发凋亡事件[18]。人类caspase-12基因可以转录成mRNA，但是由于基因被终止密码子中断，因此不会产生成熟的caspase-12蛋白，人类caspase-12在ERS诱导的凋亡中似乎不起作用[19]。而人类的caspase-4与啮齿动物的caspase-12最接近，它可能会发挥与啮齿类动物体内的caspase-12相同的作用[19-20]。

2 内质网应激与心力衰竭

心脏中的内质网通常被称为肌浆网(sacoplasmic reticulum，SR)，含有高密度的Ca2+-ATP酶，用以维持心肌细胞收缩所必需的肌浆网最佳的钙水平。其正常稳态的破坏引发ERS及相关的细胞凋亡，参与多种心血管疾病发生，是影响心力衰竭发生发展的重要因素。在培养的大鼠心肌细胞，内质网中Ca2+的耗竭诱发ERS，促进ATF6从内质网到细胞核易位，激活Ca2+-ATP酶-2(sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCA2)的启动子，最终导致SERCA2蛋白水平增加，证明心肌细胞存在ERS[21]。研究发现GRP78的mRNA水平在BNP水平升高的心力衰竭病人心脏中显著增加[22]。另外，临床研究和动物实验均证实在心力衰竭心脏中和心肌细胞肥大模型存在ERS[14]。

适度的ERS使细胞适应环境的改变，重新恢复正常的内质网功能，避免心力衰竭的发生；持续而严重的ERS则触发内质网相关细胞凋亡，造成心肌由代偿转向衰竭，是心力衰竭发生的重要分子机制[9]。

2.1 适度的ERS防止心力衰竭的发生发展 ERS信号通路及其诱导的蛋白具有细胞保护作用。GRP78是UPR的主要调节分子，GRP78的诱导表达是缓解ERS、维持内质网功能和保护细胞免于损伤所必需的。GRP78通过结合到新生蛋白暴露的疏水性残基上，确保蛋白质正确折叠并防止蛋白质聚集。在ERS发生时，GRP78被诱导表达，同时具有抗细胞凋亡的作用[23]；GRP78的表达增加可增加心肌细胞对缺氧的耐受性，保护心肌细胞免于损伤[24]。PERK作为ERS感应分子，通过减轻ERS损伤，增加SERCA2a活性，抑制心肌细胞凋亡，在防止心力衰竭进展中发挥重要作用[25]。在PERK基因敲除合并心力衰竭的小鼠模型上，发现心脏组织中PERK活性抑制加剧了充血性心力衰竭和肺重塑的发展。另有研究表明，ERS增加缺血心脏心肌细胞中脑星形胶质细胞衍生的神经营养因子(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor，MANF)的表达。MANF具有保护心肌细胞免受缺血性损伤，抗心肌肥大，避免心力衰竭发生的作用[26]。血小板反应蛋白4(thrombospondin4，Thbs4)作为ERS反应的效应分子，通过活化ATF6α，增加内质网中质量控制蛋白的表达，更有助于其产生复杂的保护性分子伴侣，发挥保护心肌细胞的作用[27]。

2.2 过度的ERS引发心力衰竭 持续而严重的ERS促进细胞凋亡，引发心力衰竭[28]。小鼠主动脉弓缩窄模型的研究表明，模型术后1周和4周的小鼠心脏分别发生心肌肥大和心力衰竭，并且ERS标志分子在心脏表达显著增加。同时在主动脉弓缩窄术后4周的小鼠心脏进行TUNEL检测，发现TUNEL阳性的凋亡心肌细胞数量显著增加，诱导内质网特异的凋亡分子CHOP的表达。表明模型小鼠的压力负荷诱导了ERS促进内质网途径细胞凋亡，是心力衰竭发生的重要分子机制[14]。在自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHRs)舒张性心力衰竭的动物模型研究发现，GRP78和caspase-12在心肌细胞表达上调，并且ERS诱导的心肌细胞凋亡参与了模型大鼠高血压引起的舒张性心力衰竭[29]。晚期人类衰竭心脏中持续的ERS导致IRE1表达增加，其内切核酸酶活性的特异性下降，失去对XBP1的特异性剪切作用，并靶向作用在附着于内质网膜结合核糖体的mRNA上。corin (一种由心肌细胞表达的跨膜丝氨酸蛋白酶，参与利钠肽前肽加工)的mRNA对这一过程很敏感。Corin mRNA的降解，导致其蛋白合成减少，使利钠肽前体原转化过程受损，介导心肌肥大向收缩性心力衰竭的进展[22]。表明ERS亦与心力衰竭的进展相关。

过度的ERS可以导致活性氧(reactive oxygen species，ROS)增多，从而引发心力衰竭病人的心律失常并发症[30]。已有的研究证明，心律失常是心力衰竭的主要死因。氧化及代谢应激使线粒体产生大量ROS，ROS可以传播到近端内质网，抑制SERCA并刺激Ⅱ型兰尼碱受体(ryanodine receptor 2，RyR2)，引发内质网的Ca2+释放。ERS和线粒体应激又反过来引发改变离子通道功能的信号级联反应并促进电生理和结构重塑，最终引发心律失常。因此，通过在ERS阶段对心力衰竭进行早期干预，降低心律失常并发症的发生。

抑制过度的ERS可以保护受损的心肌细胞，治疗心力衰竭。SERCA2a通过将胞质Ca2+泵入肌浆网，在维持细胞内Ca2+内稳态中起重要作用。而SERCA2a活性的降低导致细胞内Ca2+超载，从而诱发ERS，是心力衰竭发生的重要机制。研究发现在体动物进行人细胞色素P450基因CYP2J2过表达或体外心肌细胞给予环十二碳烯酸(epoxyeicosatrienoic acids，EET)干预，可通过恢复SERCA2a的表达和功能，明显减轻细胞内Ca2+过载与ERS，治疗心力衰竭[31]。阿托伐他汀通过下调心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌细胞中GRP78，caspase-12和CHOP表达，抑制ERS的激活及心肌细胞的凋亡，发挥心肌细胞保护作用[32]。心力衰竭会导致心肌细胞中NF-κB中p65亚单位的活化，造成心肌细胞的ERS从适应阶段转向凋亡[28]。NF-κBp65活化的衰减伴随着GRP 78和GRB 94的持续表达使ER具有更大的蛋白折叠能力；抑制NF-κB的表达会抑制CHOP，减少procaspase-12的活化，并阻止JNK1/2磷酸化和凋亡。因此，心脏中p65的靶向阻断可能是保持对ERS的适应性反应，并改善重塑心脏中的肌细胞损伤的一种有用治疗策略。高浓度的激活素A激活JNK信号通路，可通过ERS途径诱导心肌细胞凋亡，造成心力衰竭。而卵泡抑素的表达上调可以拮抗激活素A的表达，维持心肌梗死后激活素A-卵泡抑素的平衡，减弱由激活素A诱导的ERS及其心肌细胞凋亡，延缓心力衰竭进程[33]。

3 结 语

ERS是细胞自身的一种保护性反应，适度的ERS有利于心肌细胞代偿，持续而严重的ERS则触发内质网相关细胞凋亡，造成心肌由代偿转向衰竭，在心力衰竭发生发展中有重要意义。对ERS和心力衰竭之间关系的理解，有利于从ERS入手，发现预防和治疗心力衰竭的新靶点。