新城疫病毒抗肿瘤作用研究进展

操詹魁　王志玉

250012 济南，山东大学公共卫生学院病毒学研究室

癌症全球发病率近年呈上升趋势，作为主要的死因之一，癌症已严重威胁到人类健康和生命安全。常规的癌症治疗手段包括手术、放射和化疗，疗效值得肯定，但同时存在风险较高、副作用偏大、治愈率偏低等问题。随着医学技术的不断进步，病毒、基因疗法等特异性高的癌症治疗手段不断涌现，疗效也有了明显提高。溶瘤病毒(oncolytic virus)能选择性在肿瘤细胞中复制，可产生直接的细胞毒作用，杀伤肿瘤细胞，也可作为基因治疗载体、肿瘤疫苗等进行肿瘤治疗[1]。

新城疫病毒(newcastle disease virus，NDV) 是具有溶瘤活性的单股负链RNA病毒，属副粘病毒科、副粘病毒亚科、腮腺炎病毒属，基因组全长约15 kb，含6种结构基因(3′-NP-P-M-F-HN-L-5′)，分别编码磷蛋白(phosphate protein, P)、核衣壳蛋白(nucleocapsid protein, NP)、基质蛋白(matrix pro-tein, M)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(hemagglutinin-neuraminidase, HN)、融合蛋白(fusion, F)和大分子RNA聚合酶蛋白(large protein, L)[2]。NDV感染肿瘤细胞的过程需要HN和F两种膜蛋白的参与。HN蛋白具有促细胞融合、受体识别和神经氨酸酶活性，分别在病毒识别肿瘤细胞、膜融合和暴露肿瘤细胞抗原表位的过程中发挥重要作用[3]。F蛋白具有细胞融合活性，是决定病毒毒力的关键，在感染肿瘤细胞过程中与HN蛋白相互作用，共同介导病毒包膜和肿瘤细胞膜融合，使核糖核蛋白复合体(ribonucleoprotein complexes, RNPs)进入肿瘤细胞，启动病毒复制过程[4]。

禽类感染NDV后发生新城疫，表现为黏膜出血、呼吸困难等症状，严重时可导致死亡。人感染NDV后表现为轻微流感样或结膜炎症状。20世纪70年代，匈牙利内科大夫Csatary[5]发现罹患胃癌的农场主在感染NDV后出现痊愈倾向，首次发现了NDV的抗肿瘤作用[6]。随后大量的细胞、动物实验结果证明，其对恶性肿瘤有一定的疗效，溶瘤疗法也因此被认为是一种新的、潜在的恶性肿瘤治疗手段。近年来有学者利用反向遗传学重组NDV病毒，使其溶瘤效果得到进一步增强[7-9]。

1　NDV的体外抗肿瘤作用

NDV感染肿瘤细胞是其发挥抗肿瘤作用的第一步，肿瘤细胞表面分布有大量的唾液酸受体，HN蛋白识别并结合肿瘤细胞表面受体后，其同源四聚体头部上抬， 颈部与F0蛋白相互作用，水解释放融合肽介导NDV进入肿瘤细胞，开始NDV的复制和增殖[10]。Puhler等[11]拯救出标记增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)基因的重组NDV病毒MTH-68，感染肿瘤细胞后，荧光观察证实MTH-68能选择性地在肿瘤细胞中复制。其后，不断有研究表明癌细胞相比正常细胞对NDV敏感度更高，更易凋亡，且NDV的这种杀伤效应与时间、剂量成正比[12-13]。NDV选择性在肿瘤细胞复制并产生杀伤作用的机制可能与肿瘤细胞干扰素表达受阻有关，RNA病毒的复制会涉及双链RNA (double-stranded RNA, dsRNA)的合成，这种外源物质能够诱导基于Ⅰ型干扰素干扰素-α(interferon alpha, IFN-α)、干扰素-β(interferon alpha, IFN-β)的细胞防御系统，而肿瘤细胞干扰素表达缺陷，导致病毒在肿瘤细胞中的增殖不受抑制[14]。此外，Walter等[15]在研究干扰素对NDV复制的影响中发现，人胰腺癌细胞(human pancreatic carcinoma cells, HPACs)在接受IFN预处理后，细胞NDV病毒复制减少、细胞毒性下降，该实验间接证明了干扰素对NDV复制的抑制作用。NDV主要通过细胞凋亡和自噬发挥抗肿瘤作用，还可刺激机体产生固有性和适应性免疫应答来杀灭肿瘤细胞。

诱导肿瘤细胞凋亡是NDV杀伤肿瘤细胞的主要机制。肿瘤细胞凋亡使自身产生免疫原性，引起趋化因子CXCL1、CCL2和CXCL10释放，第一主要固有免疫应答者中性粒细胞在趋化因子作用下向炎症区域迁移，产生无菌性免疫应答[16-17]。Elanku-maran 等[18]的研究表明，NDV主要通过内源性信号途径启动细胞凋亡，也有部分是通过外源性信号途径启动凋亡。内源性肿瘤细胞凋亡由肿瘤细胞线粒体膜电位扰动引发通透性改变，释放细胞色素-c和其他膜间隙蛋白，激活下游caspase-9，产生凋亡小体后激活下游caspase-3，引起肿瘤细胞凋亡[19]。外源性凋亡途径可由凋亡配体物质激发，激活蛋白水解酶caspase-8，进而激活caspase-3、6、7、诱导级联凋亡反应[20]。NDV还在凋亡诱导配体(tumor nec-rosis factor related apoptosis inducing ligand, TRAIL)的杀瘤活性中起重要作用，其原理是NDV能中和肿瘤坏死因子-γ(tumor necrosis factor-γ, TNF-γ)的抗体，解除了TRAIL表达的抑制，TRAIL 在激活NK 细胞介导的肿瘤杀伤效应分子中发挥了重要的作用，增强了NK 细胞的肿瘤杀伤活性[21]。

NDV的P和NP蛋白通过内质网应激反应激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR)途径来诱导肿瘤细胞自噬，细胞自噬是细胞对外界刺激如病毒感染的一种保护性应激反应[22]。内质网是多功能的细胞器，承担功能主要有蛋白翻译后修饰以及盘区折叠成蛋白质。然而，细胞内钙稳态失调时可引起内质网功能障碍，诱发内质网应激[23]。自噬在固有性和适应性细胞免疫应答中发挥了关键性作用，自噬细胞能够释放损伤相关模式分子(damage associated molecular patterns，DAMP)，增强肿瘤细胞的免疫原性，并且促进树突状细胞(dend-ritic cells, DCs)将抗原交叉提呈给初始T细胞[24]。不断有证据表明病毒溶瘤和细胞自噬的相互作用能增强抗肿瘤免疫应答，刺激IFN-α、IFN-β、TNF-γ和白介素-1(interleukin-1, IL-1)等细胞因子的产生，在溶瘤病毒介导的癌细胞死亡中起重要的作用[25]。

2　NDV体内抗肿瘤作用

近年来利用NDV抗肿瘤的动物实验也有了实质性的进展。由于天然NDV治疗癌症效果有限，反向遗传技术一直是探索提高NDV溶瘤效果的途径。研究人员在基因水平进行NDV基因重组，病毒拯救成功后，对小鼠肿瘤模型进行动静脉、皮下或瘤内注射，观察瘤体变化情况。Schwaiger[26]建立了6-8周龄雄性C57BL/6 N小鼠DT6606PDA细胞系胰腺肿瘤模型，体内研究结果显示在NDV R75全身感染后，受NDV激活的免疫细胞启动适应性抗肿瘤免疫应答，肿瘤生长得到抑制且不再复发。重组NDV的抑瘤作用会伴随剧烈的炎症反应，自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)、巨噬细胞等增多，更易引起肿瘤细胞的凋亡[27]。除了炎性细胞外，肿瘤浸润免疫T细胞在溶瘤过程中也发挥重要作用，其能特异性识别肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen, TAA)，该研究者将TAA基因重组到NDV病毒上，拯救成功后进行瘤内注射，瘤体明显缩小，且出现强的适应性抗肿瘤免疫应答，在这一过程中，白介素-2(Interleukin-2, IL-2)能介导T细胞的活化，间接发挥抗肿瘤作用[28]。NDV病毒除了直接注射治疗外，也可以用作基因载体进行基因治疗，cd作为自杀基因的典型代表能够在载体的协助下导入癌细胞中，催化无毒的前体药物5-氟胞嘧啶 (5-Fluorocytosine,5-FC)为5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)，发挥抗肿瘤作用。Lu等[29]使用NDV病毒株作为载体，通过基因重组方法成功构建新型重组NDV rClone30-CD，并与5-FC联用，建立起小鼠肿瘤抑制实验模型，实验证明重组NDV rClone30-CD/5-FC溶瘤系统具有很强抗肿瘤特性。未来的抗肿瘤治疗将是在传统放射、化疗、手术疗法的基础上，结合基因及病毒治疗高特异性和敏感性优点，联合进行肿瘤治疗。Meng等[30]对重组NDV D90的研究结果显示，抗顺铂药物的非小细胞型肺癌细胞系A549在荷瘤裸鼠模型中被其诱导后凋亡，这提示重组NDV D90病毒株可以弥补化疗药物对某些肿瘤细胞敏感性不足的缺陷，增强其抗肿瘤作用。

3　应用NDV进行恶性肿瘤的临床治疗

目前研究发现NDV重组病毒对于晚期癌症患者有一定的疗效。Csatary等[31]早期使用减毒溶瘤疫苗菌株MTH-68/H进行了一项抗肿瘤Ⅱ期临床试验，结果显示癌症相关症状减少，高剂量组生存率比低剂量组高。由于NDV的潜在致病能力和伦理学要求，研究者们致力于提高NDV治疗的安全性，Schulze T用NDV修饰的自体肿瘤疫苗(New castle disease virus-modified autologous tumor vaccine, ATV-NDV)对癌症术后患者采取主动特异性免疫治疗(Active Specific Immunotherapy, ASI)，这项III期临床试验研究随访了50例恶性结直肠癌患者，经9-10年的随访观察，结果显示接种ATV-NDV的ASI疗法能延长患者的总体生存率和无转移生存率[32]。此外， Schirrmacher等[33]研究NDV肿瘤疫苗对免疫功能的影响中，将双特异性抗CD28融合蛋白基因(bsHN-CD28)连接到ATV-NDV病毒载体，构建重组肿瘤疫苗后对14位结直肠癌晚期患者进行治疗，结果显示病毒修饰的自体肿瘤疫苗对肝转移切除术后结肠癌患者有效，肿瘤特异性T细胞免疫应答得到增强。然而临床试验证明，即使给患者多次施加大剂量的NDV，转移癌也很难完全缓解，且容易复发，这可能是由于NDV动静脉转移到肿瘤间隙的量不够均一，或瘤内NDV扩散不良，不能达到有效的治疗浓度，并且由于先天免疫、补体和细胞外基质的阻碍，引起治疗效果偏差，长期大量使用还可能引起肿瘤耐药性增加[34]。因此，克服这些障碍对于增强NDV的溶瘤疗效有重要意义。Shobana[35]通过合成雄激素类似物R1881增强前列腺癌CaP细胞的融合特性，诱导胞内生成特异性前列腺抗原(prostate specific antigen, PSA)，针对该抗原在F蛋白上的切割位点设计出具有klql基序的rNDV，该重组病毒的前体蛋白F0仅能被PSA裂解激活，从而增强了NDV病毒在CaP细胞内复制的稳定性和靶向性。

4　展望

NDV具有溶瘤及诱发机体免疫应答的作用，可用于治疗传统方法无效的恶性肿瘤，且安全性好、无严重不良反应。重组NDV肿瘤疫苗的临床试验研究为恶性肿瘤的治疗提供了新的思路。随着对NDV溶瘤作用研究的不断深入及恶性肿瘤靶向治疗技术的不断成熟，其溶瘤效应将得到进一步增强，不良反应也会减少，这将使其作为更加高效、安全的溶瘤因子，在临床肿瘤治疗方面的应用将更具前景。

利益冲突:无

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