解淀粉芽孢杆菌TWC2诱导甘蔗抗病性相关防御酶系的研究

梁艳琼 ，吴伟怀 ，2，黄兴 ，习金根 ，李锐 ，郑金龙 ，贺春萍 *，易克贤 *

（1．中国热带农业科学院环境与植物保护研究所/农业部热带农林有害生物入侵检测与控制重点开放实验室/海南省热带农业有害生物检测监控重点实验室，海南海口571101；2．农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室/省部共建国家重点实验室培育基地—海南省热带作物栽培生理学重点实验室/农业部儋州热带作物科学观测实验站，海南儋州571737）

甘蔗是我国最主要的糖料作物，种植面积和产糖量均占全国的90%以上[1]。近几年来，随着现代甘蔗产业的迅猛发展，在过度追求高产与经济效益的发展模式下以及国外品种引进、各蔗区间相互频繁调种，为甘蔗重要病害的扩散提供了条件，再加上甘蔗种植区生态的多样性和复杂性，甘蔗病害种类和类型逐年增加，而且病害程度也逐年扩大，在种植过程中甘蔗病害因防治不力导致影响范围逐渐扩大，给我国的甘蔗安全生产带来了严重隐患[2-6]。目前世界上已知的甘蔗病害已达160余种，我国发现的有60多种，其中大陆蔗区发生的约50种[7]。甘蔗病害是造成甘蔗减产的主要因素，抗病品种选育和化学防治是目前防治甘蔗病害的主要措施，然而抗病品种选育不仅周期长，而且易因病原致病性的分化而丧失抗性，长期施用化学农药，不仅造成环境污染和农药残留，而且易使病原菌产生耐药性[8]，因此亟待寻求一种更持久、更安全的防治措施。

近年来，随着生防农药的推广使用，人们逐渐认识到生物防治的巨大发展前景，因而植物的系统诱导抗性作为一种重要的生防措施也日益受到国内外的重视[9-10]。诱导寄主细胞改变物理结构和产生生理生化反应是植物产生系统抗性的两个主要机制，其中生理生化反应变化主要是通过影响植物抗病相关防御酶的催化活动来实现的，主要包括苯丙氨酸解氨酶（PAL）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）等防御酶[11]。目前已有大量研究报道生防微生物能够诱导这些植物抗病相关防御酶发生变化，从而增强植物抗病能力[12]，因此，有关解淀粉芽孢杆菌诱导植物抗病性已成为了研究热点。王璐瑶等报道了解淀粉芽胞杆菌B1619灌根处理后番茄叶片POD、SOD和PAL活性比未处理的显著提高；MDA含量比未处理的显著降低[13]。谷医林等用解淀粉芽胞杆菌LJ1发酵上清100倍稀释液喷施黄瓜幼苗，测定黄瓜叶片中SOD、PPO、PAL三种酶的活性在不同时间点均有一个骤增的过程，其活性显著高于对照[14]。本实验室前期在台湾草上分离获得一株广谱抗性的解淀粉芽孢杆菌TWC2，以甘蔗叶片中与抗病相关防御酶类SOD、CAT、PAL、POD和PPO及MDA的含量为指标，通过TWC2菌株发酵液喷施处理甘蔗植株，测定甘蔗叶片中SOD、CAT、PAL、POD和PPO以及MDA含量的变化情况，明确TWC2菌株诱导甘蔗植株抗病性的能力，为进一步深入研究TWC2菌株的生防作用机理提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

生防菌解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）TWC2，分离自热带牧草台湾草植株叶片，由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所提供。甘蔗品种采用桂蔗24号，由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所提供。

1.2 试验方法

1.2.1 TWC2发酵液制备 将解淀粉芽孢杆菌TWC2菌株在 LB培养基（蛋白胨 10g，酵母浸出粉 5g，氯化钠10g，琼脂粉15～20g，蒸馏水1000 mL，pH自然）平板中活化，34℃恒温培养 24 h得到活化的TWC2菌株单菌落，然后挑取单菌落接种于LB液体培养基中，于34℃、200 r/min条件下振荡培养16 h即得TWC2种子液。按5%的接种量将TWC2种子液接入LB培养基中，34℃，200 r/min，摇床培养48 h获得TWC2发酵液。活菌计数后用无菌水稀释至108CFU/mL的菌悬液备用。以108CFU/mL菌悬液为1倍原液，用无菌水调节菌液浓度，稀释获得10倍稀释液及100倍稀释液。

1.2.2 TWC2发酵液诱导处理 待甘蔗苗长至30 cm左右时，选取长势一致的健康植株布置盆栽试验。设置4个处理，处理1为1倍原液，处理2为10倍稀释液，处理3为100倍稀释液，处理4以喷洒等量LB液体培养基为对照。分别取50 mL上述不同处理的培养液均匀喷洒植株叶面，每处理20株。

1.2.3 甘蔗植株抗病相关防御酶活性测定 各处理组分别于喷洒后第24、48、72、96和120 h随机选取5株甘蔗苗，采集每株植株的顶端叶片1g，加入提取液在冰上研磨至匀浆，提取粗酶液，取上清液用于CAT、SOD、POD、PAL和PPO酶活测定。各物质测定分别采用CAT试剂盒（CAT-1-Y）、SOD试剂盒（SOD-1-Y）、POD试剂盒（POD-1-Y）、PAL试剂盒（PAL-1-Y）、PPO试剂盒（PPO-1-Y）。试剂盒均由苏州科铭生物技术有限公司提供，测定方法根据各试剂盒使用说明进行。

1.3 数据处理

试验所得数据用Excel 2007作图，采用SAS统计软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 TWC2发酵液处理后甘蔗叶片CAT活性变化

由图1可知，经TWC2喷洒处理后，各浓度处理组的CAT活性均高于对照组，其中10倍和1倍稀释液处理组活性均表现为随时间的增加先升高直至峰值后逐渐降低，且CAT酶活性分别在48和72 h达到峰值，此时酶活差异最大，与对照处理组差异最显著（P＜0．01）；而100倍稀释液处理组CAT酶活略高于对照，但差异不显著（P＞0．05），且其酶活随时间的增加呈平稳的趋势。

2.2 TWC2发酵液处理后甘蔗叶片PAL活性变化

由图2可知，PAL活性测定结果表明，10倍稀释液处理组PAL活性呈先上升后下降的趋势，并在第72h时达到峰值，是对照组的2．24倍；1倍稀释液处理组PAL活性在48 h出现短暂降低后持续增高，在第96h时达到峰值184．59 U/g，与对照组差异达到显著；100倍稀释液处理组与对照组的PAL活性在各时间点均无显著性差异，也没有出现明显峰值，可能是菌液浓度太低。

2.3 TWC2发酵液处理后甘蔗叶片POD活性变化

由图3可知，经TWC2发酵液处理后，10倍稀释液处理组的POD在0～72h呈急速增长的趋势，在72h时达到峰值26746．38 U/g，与对照组活性差异达到极显著水平；1倍稀释液和100倍稀释液处理组POD活性先缓慢上升，在96h时达到峰值后缓慢下降，峰值分别为15715．63 U/g和 10414．18U/g，是对照组的 3．61和 2．20倍，与对照组的差异分别达到极显著和显著水平。

2.4 TWC2发酵液处理后甘蔗叶片SOD活性变化

SOD活性测定结果（图4）表明，经TWC2发酵液诱导后的3个处理组SOD活性均呈现先急剧增长后下降的趋势，活性变化明显，且在诱导后第48h到达峰值，其中1倍和10倍稀释液两个处理组 SOD活性分别达到 1402．86和1244．53 U/g，是对照组的 5．42 和 4．81 倍，与对照组差异达极显著水平；100倍稀释液处理组的酶活是对照组的2．33倍，峰值为604．70 U/g，对照组的酶活变化不大，与其他3组处理SOD酶活差异显著。

2.5 TWC2发酵液处理后甘蔗叶片PPO活性变化

PPO活性测定结果（图5）表明，经TWC2发酵液喷洒诱导后的处理组PPO活性均表现出先增高后降低的趋势，对照组的PPO活性基本无明显变化。经TWC2发酵液诱导处理后，10倍稀释液处理组PPO活性在第48 h达到最高值63．71 U/g，是对照组的2．46倍，与对照差异极显著，诱导效果最好；1倍稀释液处理组的PPO活性峰值在第48h出现，是对照组的1．59倍，与对照组差异显著，但在随后的时间内无明显变化；100倍稀释液处理组的PPO活性在第48 h达到峰值，而后缓慢降低至与对照接近的水平，与对照差异不显著。

2.6 TWC2发酵液处理后对甘蔗叶片MDA含量的影响

由图6可知，对照组的MDA含量比较稳定，无明显变化。与对照处理组相比，10倍稀释液处理组MDA含量在24～48h时下降，比对照组降低了43．12%，之后MDA含量呈上升-下降趋势，在72h达到峰值。1倍稀释液和100倍稀释液处理组的MDA含量呈先上升后降低的趋势，并在72h时达到峰值，MDA含量分别为10．13μmoL/g 和 11．64μmoL/g。

3 讨论

诱导植物抗病性包括系统获得抗病性和诱导系统抗性。由生物防治拮抗菌所引起的植物系统抗病性属于诱导系统抗性。寄主防御酶系、病程相关蛋白（PR-蛋白）、活性氧现象及木质素的积累是诱导抗性的重要表征[15]。SOD和POD是植物体内清除活性氧毒性的保护酶，POD还能催化酚类物质合成木质素，使受侵染组织的木质化程度加深，SOD、POD活性的高低与植物抗逆性密切相关[16]。PAL是苯丙烷类代谢途径的限速酶与关键酶，其参与代谢途径合成的中间产物（如酚类物质、木质素等）是植物体内重要的抗菌物质[15，17]。CAT作为重要的内源活性氧清除剂，可以清除体内的过氧化氢，是生物防御体系的关键酶之一[18]。乔俊卿等发现枯草芽孢杆菌菌株PTS-394灌根番茄后，番茄叶片中PAL、POX、LOX和PPO的活性均有不同程度的持续增加，诱导番茄产生系统抗病性，从而提高其对番茄灰霉病的抗性[19]。陈刘军等研究发现蜡质芽孢杆菌AR156诱导水稻植株提高了PAL、SOD、CAT和POD等防御酶活性，从而提高水稻对纹枯病的抗性[20]。由此可知，生防菌对植物抗病相关防御酶的诱导是生防微生物防治植物病害发生的重要机制之一。本研究通过测定施用解淀粉芽孢杆菌发酵液后甘蔗叶片不同生长时期与诱导植物抗病性密切相关的植株酶活力（PAL、POD、SOD、PPO、CAT）变化的结果表明，解淀粉芽孢杆菌TWC2发酵液处理后甘蔗叶片几种防御酶活力均有所上升，这个结果说明TWC2一定程度上诱导了甘蔗体内抗性酶活性的增高，使甘蔗植株产生了更高的抗病酶活力，增强了植物的抗病能力，进一步说明了其作为生物农药的良好应用前景。

本研究中经解淀粉芽孢杆菌TWC2发酵液10倍稀释液处理甘蔗叶片，叶片中抗病相关酶系（PAL、SOD、POD、PPO）显著高于其他浓度处理，与唐文等[18]、傅莹等[21]的研究结果相符，表明提高发酵液浓度并不一定能诱导植株防御酶活性升高，拮抗菌发酵液浓度与诱导植物产生抗性的效果并非呈正相关。

丙二醛（MDA）是膜脂过氧化分解的主要产物，其含量的高低反映了植物细胞膜受损害程度以及植物耐受逆境条件的能力，MDA的大量累积可影响电解质外渗，严重时甚至可使细胞死亡[21]。本试验结果表明，施用TWC2发酵液后，其体内的抗病相关防御酶水平会显著提高，而MDA含量变化呈平稳趋势，与对照组相比，处理组的MDA含量均显著降低，证明TWC2菌株可有效抑制因病原菌作用引起的MDA含量升高，降低甘蔗植株受损害的程度，提高植株的抗病性。