ISSR分子标记技术在甜菜育种中的应用

邹奕 ，马龙彪 ，2，3，江伟 ，李文晶 ，吴则东 ，2，3*

（1．黑龙江省普通高等学校甜菜遗传育种重点实验室，哈尔滨150080；2．中国农业科学院甜菜研究所/黑龙江大学农作物研究院，哈尔滨 150080；3．中国农业科学院北方糖料作物资源与利用重点开放实验室，哈尔滨150080）

甜菜是许多国家的重要经济作物，其商业栽培已延伸至世界上50多个国家。栽培甜菜分为食用甜菜、饲用甜菜、叶用甜菜和糖用甜菜，目前在我国种植面积最大的是糖用甜菜，2014—2016年每年的播种面积13．5万公顷～14．9万公顷（据中国农业年鉴网）。糖用甜菜是世界上主要的糖料作物，甜菜糖大约占到世界食糖总量的25%。目前我国甜菜发展主要面临几个困境，一是随着国产新品种的不断增加和外来品种的引进，品种鉴定难度逐渐增大，仅根据表型特征区分品种是困难的，因此建立一套快速鉴定甜菜品种的检测方法至关重要，而通过DNA分子鉴定方法检测品种，将节省大量的时间[1]；二是甜菜病害较为严重，常见的甜菜病害包括褐斑病、根腐病、丛根病等，病害的防治主要是依靠化学药剂，容易引起农药残留和环境污染，长期使用会产生抗药性，因此，抗病品种的筛选尤为重要；三是国外进口甜菜品种基本占据了我国甜菜种子市场的95%以上，亟需优质国产种子补充市场。

区间简单重复（Inter-simple sequence repeat，ISSR）标记技术是基于PCR的一种分子标记技术，该技术通常利用长16～25bp的微卫星作为引物，在单引物PCR反应中靶向多个基因座，主要扩增不同大小的SSR间序列。所使用的引物可以是未锚定的、或者通常在3′或5′端锚定1至4个简并碱基延伸到碱基序列。ISSR技术将AFLP和微卫星分析的大部分优点与RAPD的普遍性相结合。ISSR具有很高的重复性，可能是由于使用了较长的引物（16～25 mers），与 RAPD 引物（10-mers）相比，可以使用高退火温度（45～60℃），从而具有更高的严格性。研究表明，只有最微弱的谱带是不可重现的[2]。当使用聚丙烯酰胺检测时，92%～95%的片段可以在相同栽培品种的DNA样品上重复[3]。ISSR分子标记自建立以来就已被广泛用于植物遗传多样性分析、DNA指纹图谱构建或品种鉴定等[4]，并在甜菜分子育种上得到了较为广泛的应用。本文将就ISSR分子标记在甜菜育种上的应用进行综述，并对ISSR分子标记技术在甜菜上的未来发展进行展望。

1 ISSR分子标记技术在甜菜育种中的应用

1.1 甜菜的抗病育种

吴旭红[5]使用ISSR分子标记，对甜菜高抗品种ZD204及其杂种后代的抗病基因进行标记，以达到使用分子标记来辅助抗病育种的早期鉴定并选择杂种的目的。对KWS9419株系和ZD204的杂交后代采用BSA法和RAPD分析，获得了和甜菜抗根腐病基因连锁的RAPD标记0PP084760，然后将其转变为ISSR标记，可以对甜菜杂种的幼苗期抗根腐病基因进行分子标记鉴定。吴旭红[6]还应用ISSR技术，用80个ISSR引物对两亲本甜菜基因组DNA进行扩增，77．5%的扩增条带清晰，其中42条在亲本间表现出多态性条带。引物BA0061在ZD204中扩增出1200bp的多态性条带，证明了3个不同遗传背景的甜菜品种（系）中可以扩增出标记BA0061-1200，已知含有该抗性基因1200bp条带，而其他3条不含有这个抗性基因没有扩增产物。这表明标记BA0061-1200更具有特异性，在检测抗性基因方面具有很大的潜力。利用ISSR标记分析F2群体的抗病性，表现了ISSR标记的可行性和优越性。

1.2 开发SSR引物

牛泽如等[7]使用ISSR标记开发了甜菜SSR引物。试验设计思路是以AFLP-PCR和ISSR-PCR为基础，结合基因组步移，构建基因组文库，然后扩增两个微卫星之间的序列进行基因组步移，获得另一端微卫星序列。ISSR-PCR定位于SSR区域，并对含有SSR序列的片段进行进一步靶向选择，起到了富集微卫星片段的作用，这种方法不使用放射性探针标记和繁琐的杂交，便捷安全，微卫星获得率较高。因为ISSR引物具有通用性，并且有很多不同限制性内切酶可供使用，只要可以设计合适的PCR引物并得到满足SSR引物设计的片段，就可以得到想要的SSR引物。

1.3 甜菜种质资源和品种遗传多样性分析及指纹图谱构建

刘华君等[8]对18份来自德国的甜菜品种和2份来自瑞士的甜菜品种进行遗传图谱的构建和聚类分析，从100个ISSR引物中筛选出了7个具有良好多态性的ISSR引物，使用7个ISSR引物扩增了20个甜菜种质资源，共得到了39个等位变异，每个引物检测到3～8个等位变异，平均等位变异为5．6个，其中30条多态性条带，7 套 ISSR 引物的多态信息含量（PIC）为 0．6273～0．8360，平均数 0．7650，20 个供试品种的遗传相似系数为0．4615～0．9231，平均数0．6923。傅增娟[9]首先对甜菜ISSR-PCR反应体系进行了优化，确定了合适的反应体系和扩增程序，利用ISSR分子标记技术鉴定了33个甜菜种质资源，仅利用1条引物就鉴别了10份甜菜种质资源。刘巧红等[10]利用两条ISSR引物就成功地鉴定了10个不同来源的甜菜品种，遗传相似系数为0．43～0．83，平均为 0．62。 Izzatullayeva等人[11-12]利用 ISSR 和 RAPD 对甜菜品种的遗传多样性进行评价，其中12条ISSR引物共产生178个条带，其中173条为多态性条带，发现ISSR引物更加适合甜菜的遗传多样性分析。Srivastava等人[13]利用同工酶、RAPD和ISSR共同对甜菜品种进行遗传多样性分析。表明ISSR分子标记技术可以有效地进行甜菜品种和资源的指纹图谱构建以及遗传多样性分析。 Amini等人[14]利用ISSR标记分析伊朗甜菜引起根腐病的腐霉菌的遗传多样性，从伊朗8个省搜集到的19个腐霉菌的分离纯化物，利用8个ISSR引物进行分析，结果表明，8个省的腐霉菌之间均有亲缘关系，亲缘关系的远近和地理分布没有必然的联系。

1.4 ISSR分子标记在甜菜其它方面的应用

Kiyoshi[15]等人分别从甜菜叶片、根以及叶柄中提取立枯丝核菌，利用后代的体细胞亲和性分组研究了田间分离株的遗传变异，体细胞相容性群体的数量与获得亲本分离株的宿主植物组织密切相关，来自根和叶柄的分离物往往是遗传异质性的，并且产生多个体细胞亲和组，而来自叶的分离物倾向于是均质的，并且产生单一的体细胞亲和组，这些发现得到了ISSR分析结果的支持，表明均质分离物产生了具有相同基因型的后代，而异源分离物产生了具有不同基因型的后代。Fayed等人[1]分别利用3个不同耐虫基因型的甜菜，采用同工酶技术和ISSR分子标记技术，找到了与耐虫相关联的ISSR标记。Sen等人[16]利用ISSR标记分析用γ射线辐射诱导的耐旱甜菜突变体，在对照和耐旱突变体中检测到多态性，利用19条ISSR引物，共扩增出106个PCR片段，其中91个为多态性片段。刘乃新等[17]筛选出了5条ISSR引物，建立了甜菜老化处理后ISSR特异性谱带。刘乃新等人[18]还对甜菜ISSR引物扩增产物的检测方法进行了研究，分别对使用6%的聚丙烯酰胺凝胶以及2%的琼脂糖检测的使用范围进行了分析，指出对于指纹图谱的构建以及遗传多样性的分析等适宜于用6%的聚丙烯酰胺凝胶，而品种纯度检测则需要使用2%的琼脂糖凝胶。

2 ISSR分子标记技术在甜菜育种中应用的前景与展望

随着分子生物学的发展，ISSR分子标记技术具有容易操作、可靠性高、重复性强、多态性好等优点，已趋于成熟。ISSR已被成功地应用于估计多种作物品种如水稻[19]、小麦[20]、穇子[21]、豇豆[22]、甘薯[23]和车前草[24]的遗传多样性分析；在一项关于白羽扇豆的研究中，已经证明在10个引物中，任何两个都足以区分所研究的37份材料[25]；同样，4个引物足以区分34个品种的马铃薯[26]，3个引物能够区分16个红浆果基因型[27]，使用这种高信息量的引物降低了多样性分析的成本、时间和劳动力。尽管ISSR标记具有较高的效率和可重复性，但尚未广泛使用，然而，在解决亚洲栽培稻[19]、小麦[20]、穇子[21]、豇豆[22]和二行芥物种[28]的系统发育有关的问题方面已被发现是有效的；另外ISSR分子标记还广泛应用到遗传图谱的构建上，如在日本和欧洲落叶松基因组的图谱中，ISSR也与AFLP和RAPD标记一起使用[29]。柑橘的遗传连锁图谱使用75个ISSR标记，分布在所有连锁群中[30]。与重要的农艺性状密切相关的DNA标记极大地促进了作物改良计划。在水稻中，将由引物（AG）8YC产生的ISSR标记转化为序列标签位点（STS）标记以鉴定育性恢复基因Rf-1[31]。在鹰嘴豆中，由引物（AG）8YT和UBC 8251200引物（AG）8T产生的ISSR标记UBC 855500与赋予对枯萎病的种族4抗性的基因[32]连接。

目前ISSR分子标记技术在甜菜上的应用还比较少，未来应积极地拓宽该技术在甜菜遗传育种研究上应用的深度，特别是在甜菜遗传多样性分析、种质资源鉴定、品种鉴定以及抗性育种等方面，积极借鉴在其他作物上成功应用的经验，可有效缩短育种年限、提高育种效率，推动甜菜遗传育种的研究发展，促进甜菜品种的育成和更新换代。