五味子半仿生提取物改善小鼠睡眠的作用研究

杨彩媚

(漳州卫生职业学院，漳州 363000)

目前市场上改善睡眠的药物主要通过对相关的神经递质产生作用而延长睡眠时间，但容易产生比较强烈的依赖性和停药反应，目前仍没有较为理想的催眠药[1]。而中药及其提取物展现出一定的优势。五味子为木兰科多年生藤本植物五味子的干燥成熟果实，本品酸、甘、温，归肺、心、肾经，具有收敛固涩，益气生津，补肾宁心的作用，用于久嗽、梦遗滑精、遗尿尿频、久泻不止、自汗盗汗、津伤口渴、内热消渴和心悸失眠[2]。半仿生提取法(SBE)是将整体药物研究法与分子药物研究法相结合而创立的一种中药和方药提取的新技术[3,4]，该法模拟胃肠道环境，采用一定pH值的酸性和碱性水依次提取得到有效成分更高的活性混合物。有文献报道，半仿生提取法有效成分提取量优于传统的水、乙醇-水提取法[5-7]。本研究运用半仿生法提取原理，考查五味子的半仿生提取物对小鼠睡眠功能的影响。

1 材料与试药

pHS-3C型精密pH计(上海雷磁仪器厂)；BS110 电子天平(德国赛多利斯公司)；秒表；灌胃针；1 ml注射器等。五味子(江西致和堂药业有限公司，产地辽宁，批号16001)；戊巴比妥钠、巴比妥钠(北京普博斯生物科技有限公司，白色粉末，纯度大于99%，批号3761)；试验用水为蒸馏水，浓盐酸和氢氧化钠均为分析纯。

2 实验方法

2.1提取溶剂的配制 参照半仿生原理，模拟人体胃肠道环境，用水作为提取溶剂，1 mol/L的氢氧化钠和1 mol/L盐酸调节溶剂的pH值，使pH值分别为2.0、7.5和8.3[7]，备用。

2.2五味子半仿生提取物的制备 取五味子100 g，浸泡30 min，依次加入10倍量的pH值分别为2.0、7.5和8.3的酸水和碱水，常压下加热回流提取3次，每次30 min。将三煎提取液粗滤，5 000 r/min离心10 min，合并上清液，用旋转蒸发器浓缩至200 ml，得到0.5 g/ml的五味子半仿生提取物。

2.3动物分组与剂量选择 供试动物为ICR小鼠，雄性，160只，体重(20±2)g，由闽侯县吴氏实验动物中心提供，动物许可证号SCX(闽)20042002。小鼠正常饲养3 d后，随机分成四组，每组40只。受试样品设置低(5倍)、中(10倍)、高(30倍)3个不同的剂量，分别是4.5、9.0和27.0 g/kg，灌胃30 d，末次给药后20 min测定各指标。

2.4改善睡眠保健功能的评价[8]本实验依据卫生部《保健食品检验与评价技术规范》(2003 年版)，按照改善睡眠功能检测方法，评价五味子半仿生提取物对小鼠睡眠的改善作用。实验安排晚8点进行。

2.4.1直接睡眠实验 五味子半仿生提取物组每日按时灌胃，阴性对照组灌胃给予同等体积的蒸馏水，睡眠以翻正反射消失为指标，末次给药后观察各组小鼠是否出现睡眠现象，记录阴性对照组与五味子给药组入睡动物数及睡眠时间。

2.4.2延长戊巴比妥钠睡眠时间实验 通过前期预实验，小鼠100%入睡并且睡眠时间不会过长的戊巴比妥钠的剂量为50 mg/kg。戊巴比妥钠临用配制，称取戊巴比妥钠0.05 g，生理盐水溶解，定容于10 ml量瓶中，配制成浓度为5 mg/ml戊巴比妥钠溶液。各组小鼠末次给予不同剂量五味子提取物及蒸馏水20 min后，腹腔注射戊巴比妥钠。在戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠的基础上，以翻正反射消失为指标，观察五味子提取物组能否延长小鼠的睡眠时间。

2.4.3戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验 通过前期预实验，戊巴比妥钠的最大阈下剂量为30 mg/kg，即使80%～90%小鼠翻正反射不消失的戊巴比妥钠剂量。戊巴比妥钠临用配制，称取戊巴比妥钠0.03 g，生理盐水溶解，定容于10 ml量瓶中，配制成浓度为3 mg/ml戊巴比妥钠溶液。各组小鼠末次给予不同剂量五味子提取物及蒸馏水20 min后，腹腔注射戊巴比妥钠最大阈下催眠剂量，记录30 min内入睡小鼠数(翻正反射消失达60 s以上者)，计算睡眠发生数。

2.4.4巴比妥钠睡眠潜伏期实验 通过前期预实验，小鼠100%入睡并且睡眠时间不会过长的巴比妥钠剂量为300 mg/kg。巴比妥钠临用配制，称取巴比妥钠0.3 g，取适量生理盐水溶解，定容于10 ml量瓶中，配制成浓度30 mg/ml巴比妥钠溶液。各组小鼠末次给予不同剂量五味子提取物及蒸馏水20 min后，腹腔注射巴比妥钠，以翻正反射消失为指标，观察睡眠潜伏期(从巴比妥钠注射开始，至小鼠翻正反射消失达60 s的这段时间为睡眠潜伏期)。

2.4.5数据处理及统计分析 实验数据用SPSS 13.0软件进行分析，分析差异显著性。

3 结果

3.1五味子半仿生提取物对小鼠的直接睡眠实验 各组小鼠分别给予受试物和蒸馏水后，观察60 min，给药组与阴性对照组均无睡眠现象，翻正反射存在。小鼠活动正常，精神状态正常，说明五味子半仿生提取物没有直接催眠的功能，结果见表1。

表1 不同组别小鼠直接睡眠实验结果

3.2五味子半仿生提取物对延长戊巴比妥钠睡眠时间的影响 与阴性对照组相比，各给药组均能明显延长小鼠的睡眠时间，与阴性对照组比差异显著(P<0.05)。表明五味子半仿生提取物各剂量组与戊巴比妥钠有协同作用。结果见表2。

3.3五味子半仿生提取物对巴比妥钠阈下剂量催眠的影响 各给药组均不能明显增加小鼠在30 min内的入睡率，与阴性对照组相比差异性不显著。结果见表3。

表2 不同组别对延长戊巴比妥钠睡眠时间的影响

注：与阴性对照组比较*P<0.05

表3 不同组别对戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验的影响

3.4五味子半仿生提取物对巴比妥钠睡眠潜伏期的影响 五味子半仿生提取物各剂量组均能明显缩短小鼠睡眠潜伏期，与阴性对照组相比差异显著(P<0.05)。结果见表4。

表4 不同组别对巴比妥钠睡眠潜伏期的影响

4 讨论

五味子是一种十分珍贵的中药材，因其具有良好的药用价值和营养价值，不仅在临床上广泛使用，在民间也常常作为养生保健品。我国五味子资源丰富，因此具有极强的市场开发价值。

本研究首次以半仿生提取法提取五味子中的活性成分，以活性混合物进行改善小鼠睡眠作用的研究，实验结果表明，五味子半仿生提取物各剂量组(5倍、10倍、30倍)均能延长戊巴比妥钠睡眠时间，能明显缩短小鼠巴比妥钠睡眠潜伏期，并且没有直接睡眠作用。根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)[8]，表明五味子半仿生提取物各剂量组均具有改善睡眠的作用。遗憾的是本实验根据《保健食品检验与评价技术规范》中的要求以10倍剂量作为中间剂量，选取了5倍、30倍作为低、高剂量设置了剂量梯度，而实验结果显示这3个剂量组之间并没有显著的差异性，应进行进一步的摸索和探讨。本研究采用半仿生提取的方法，符合中医中药综合成分相互作用的特点，提取方法更加简便，缩短了生产周期，节约成本。从理论上讲，该提取物已经经历了胃肠道有关酶的生物转化，生物活性增强，可以作为口服制剂以及保健品的生产原料，为五味子提取物改善睡眠保健品的开发奠定了基础。而对于五味子半仿生提取物中的成分以及改善睡眠的作用机制，还有待于进一步深入研究。

1 赵世晶,孙渠.镇静催眠药物的研究进展[J].黑龙江科技信息,2014，15:72

2 中国药典[S].一部.2015:66-67

3 张兆旺,孙秀梅.试论“半仿生提取法” 制备中药口服制剂[J].中国中药杂志, 1995,20(11)：670-673

4 孙秀梅,张兆旺.建立中药用“半仿生提取”研究的技术平台[J].中成药,2006,28(4): 614-616

5 郭志红,周鸿立. 玉米须多糖和黄酮的半仿生提取及抗氧化活性[J]. 江苏农业科学,2015,43(4):273

6 张慧,谭秋龙,黎行山,等.结合响应面分析法优化复方金钱草中君药的半仿生提取工艺[J].广东药学院学报,2013,29(1):29-34

7 王蕙,付燕,郎久义,等.酶法及半仿生法提取银杏黄酮的工艺研究[J].辽宁中医药大学学报,2009,11(2):146-148

8 中华人民共和国卫生部.保健食品检验与评价技术规范[M].北京:清华同方电子出版社(3版),2003:81-83