人脐带间充质干细胞移植治疗脊髓损伤的研究进展

陈奇 孙翊夫 吕晓霞 张福强 顾锐 高旭 邵立伟 姜金兰,

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）多见于创伤意外导致患者感觉运动功能障碍甚至瘫痪，当前临床治疗手段包括手术减压固定，药物治疗，对症支持治疗及后期康复锻炼[1]，但鉴于SCI复杂病理生理和人体相对不能修复或再生神经细胞，所以当前治疗措施仅能减少残存脊髓功能的继续受损[2]。干细胞具有增殖和分化成各种组织器官的潜力，因此干细胞移植治疗被认为是修复SCI最有希望的方法[3]，其中人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUC-MSCs）与其他种类干细胞相比具有获取容易，污染少，成本低且无伦理争议的优势[4]。HUC-MSCs主要来源于脐带华通氏胶[5]，是一种长梭形、核大、胞浆丰富的成纤维样贴壁细胞，在特定条件下可向神经细胞[6]、成骨细胞[7]、软骨细胞[8]、脂肪细胞[9]和心肌细胞[10]等分化。HUC- MSCs表面高表达间充质细胞标志物（CD90、CD44、CD105、CD59等），而造血细胞标志物（CD34、CD14、CD45、CD117等）不表达[11]，人白细胞抗原（HLA-DP、-DR、-DQ等）及免疫应答相关表面抗原（CD40、CD80、CD86等）不表达或低表达，因此异体移植无排斥反应或仅有较弱反应[12]。正因这些独特优势HUC-MSCs现已广泛应用于各种再生医学和组织工程方面，并且已经从基础研究逐步应用于临床治疗[13]。

近年HUC-MSCs的培养及诱导分化技术不断改进。Li等[14]用一种新的三维系统构建细胞生长复杂的微环境，使HUC-MSCs在无血清培养基生长形成球状体并保持高活性增殖。三维系统较单层培养在相同体积内获得更多细胞，球状体高表达干细胞标志物且显示出更强多能性。Salehinejad等[15]尝试不同组合体外诱导HUC-MSCs分化成神经细胞，发现将基础培养基、胎牛血清、成纤维细胞生长因子、视黄酸和表皮生长因子组合时诱导HUC-MSCs，其表达巢蛋白、β微管蛋白Ⅲ等神经细胞标志物最多。另外Dehghani-Soltani等[16]发现将第3代HUC-MSCs经发光二极管红光和绿光照射后，经过基因，蛋白质和形态学水平的检测证明其向神经细胞分化，提示发光二极管照射和光遗传学技术可用于再生医学中的神经分化和神经修复。干细胞向神经细胞分化，分泌神经营养因子[17]和抑制炎症反应及细胞凋亡[18]被认为是干细胞移植治疗SCI的基础。

一、HUC-MSCs单独移植治疗SCI

Chen等[19]将来源于足月健康新生儿的HUC-MSCs培养至第5代，然后诱导分化成少突胶质细胞前体样细胞，在制备SCI大鼠模型后1周将5 μl含有1×106个少突胶质细胞前体样细胞的盐水注射移植至局部病损处，大鼠未行抗免疫排斥相关处理。移植8周后，生物素多聚葡聚糖胺追踪发现SCI处皮质脊髓束密度增加，免疫荧光染色证实再生髓鞘来自中枢神经系统；11周后，运动功能评分（basso beattie bresnahan，BBB）显示实验组恢复最佳，整个过程未观察到免疫排斥反应，如呼吸困难、脱毛、猝死和活动异常等，证明HUC-MSCs分化的少突胶质细胞前体细胞促进脊髓轴突和髓鞘再生，改善神经功能且免疫耐受性良好。Li等[20]观察HUC-MSCs静脉移植治疗急性期SCI大鼠的疗效，将培养至第3 ～ 4代的HUC-MSCs以1×106个细胞经股静脉移植，未使用任何免疫抑制剂。术后4周干细胞移植组BBB评分提示运动功能恢复最好，神经生长因子表达增加，白介素（interleukin，IL）-1β表达减少，所有大鼠均未发现免疫排斥反应。结果显示HUC-MSCs可以改善SCI病灶微环境，缓解继发损伤，促进神经功能恢复且免疫耐受佳。Yang等[21]研究HUC-MSCs重复移植对兔双节段SCI的疗效，在兔SCI后1天通过耳缘静脉以1次总剂量6×106或分3次剂量（间隔3 d）植入培养至3 ～ 5代的HUC-MSCs，未行抗免疫排斥处理。术后1 ～ 7周检测干细胞移植组行为学评分显示运动功能提高，重复移植组前角运动神经元数目，体感诱发电位潜伏期及HUC-MSCs归巢率等与单次移植组相比改善更佳，并且未出现免疫排斥反应。结果提示兔功能恢复可能与干细胞神经保护、抑制细胞凋亡特性有关且多次重复移植效果更佳。此外Krupa等[22]局部移植HUC-MSCs治疗SCI大鼠研究结果亦支持上述结论，Krupa观察干细胞不同剂量（0.5×106或1.5×106个细胞）和重复鞘内移植（第7天，第14天和第21天）疗效，组织化学分析发现随着移植细胞剂量和应用次数的增加，大鼠生长相关蛋白43+纤维数量增加且灰质保留更多，巨噬细胞标志物的表达和细胞凋亡减少，证明干细胞对脊髓再生影响是剂量依赖性的，可以通过反复应用加强。

二、HUC-MSCs联合移植治疗SCI

SCI复杂病理生理及局部恶劣微环境以致任何单独治疗措施均不足以修复受损脊髓，因此干细胞与其他组分联合移植治疗SCI成为新兴研究热点[23]。通过联合药物，细胞因子，基因修饰技术，生物材料等移植，可充分发掘各组分之间协同作用，为治疗SCI提供有利修复条件[24]。

Wang等[25]用槲皮素与HUC-MSCs联合局部注射至大鼠SCI病损处，槲皮素是一种有抗氧化和清除自由基潜能的天然类黄酮。4周后联合移植组大鼠BBB评分显示更好的功能恢复，轴突变性减少，巨噬细胞极化增加，IL-1β、IL-6等炎性细胞因子降低，抗炎细胞因子IL-4，IL-10、转化生长因子-β1等增多，表明HUC-MSCs联合槲皮素移植是减少SCI继发损伤，促进功能恢复的潜在途径。Guo等[26]将HUC-MSCs体外诱导分化成雪旺氏细胞，与神经营养因子（neurotrophin，NT）-3移植至SCI局灶病损处，NT-3对神经细胞的发生、存活及修复十分重要。结果提示联合移植治疗的大鼠运动功能较其他组恢复更佳，损伤区域移植细胞存活率更高，病理程度破坏最少。白刚等[27]将NT-3基因转染HUC-MSCs，促使其向神经元分化并高表达NT-3，然后联合基因沉默细胞因子抑制蛋白3治疗脊髓全横断大鼠。术后检测联合治疗组脊髓空洞减少，神经电生理功能极大改善。细胞因子抑制蛋白3抑制内源性神经营养素并阻碍轴突再生，联合基因修饰技术可以减少其对脊髓功能恢复的影响，但修饰基因是否稳定表达及长期安全性如何仍需进一步监测。Jiao等[28]利用HUC-MSCs与丝素蛋白/海藻酸盐/神经营养因子复合支架联合移植至SCI大鼠局部病灶处。丝素蛋白作为支架材料，改善细胞黏附迁移及增殖分化，海藻酸盐作为神经营养因子载体，丝素蛋白和海藻酸盐结合使用改善神经营养因子控制释放。结果发现炎症反应标志物IL-1β，IL-6、肿瘤坏死因子-α降低，神经元标志物微管相关蛋白2，神经元核抗原及巢蛋白阳性细胞数目增加，表明HUCMSCs向神经细胞分化趋势增加。陈洪丽等[29]发现HUCMSCs体外培养时经635 nm和双波长弱激光作用后增殖速度加快，然后局部移植治疗SCI大鼠。术后检测IL-1、IL-6、神经丝蛋白-200和胶质纤维酸性蛋白分泌和表达增多，大鼠病损处纤维束互相交织且尼氏小体数目增加，原因可能与双波长弱激光诱导氧化应激反应水平较低，提高细胞抵抗能力有关。另外近年超顺磁性氧化铁颗粒标记的干细胞通过磁靶向系统汇聚至SCI局部成为热点，这种联合移植策略提高干细胞移植疗效，未来有望应用于临床[30]。

三、移植途径

干细胞移植途径当前主要包括局部病灶内移植、静脉途径移植和蛛网膜下腔移植。局部病灶注射干细胞定植率高，但可能造成脊髓二次损伤降低疗效[31]；静脉途径受血-脑（脊髓）屏障影响，细胞可能扩散丢失较多[32]；而蛛网膜下腔注射将干细胞通过脑脊液循环抵达局部病损，不良事件较少发生[33]。刘雨亮等[34]取培养至第5代的HUC-MSCs制备成浓度为1×109个/L的细胞悬液，比较经局部移植和静脉途径治疗SCI大鼠的效果。移植4 ～ 12周后，两组局部病损处可检测到5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷标记的干细胞，大鼠BBB评分提示肢体运动功能改善，苏木精-伊红染色显示SCI处的空洞和瘢痕减少，并且静脉移植组与局部移植组疗效差异无统计学意义。静脉途径更加简便，无局部移植的创伤、感染、出血等问题，但静脉途径需在SCI急性期血脊髓屏障通透性增加时进行移植，细胞才能更多迁移到损伤部位。韩明远等[35]用来源于足月顺产胎儿脐带的HUC-MSCs体外培养至第5代，制备浓度为2×105个/μl细胞悬液，然后经寰枕膜附近蛛网膜下腔注射5 μl的HUC-MSCs悬液治疗SCI大鼠。12周后大鼠运动功能和神经电生理恢复均有改善，免疫荧光染色发现SCI局部病灶内HUC-MSCs分化成少突胶质细胞并形成髓鞘，局部瘢痕减少且无不良事件出现，提示蛛网膜下腔注射是一种较为安全理想的方式，但由于不同移植次数、不同剂量及动物与人体的差异等因素可能影响效果，因此临床应采用何种移植途径有待设计严谨的随机对照试验（randomized controlled trial，RCT）进一步探索。

四、移植时间

SCI急性期炎症反应较重致局部微环境恶劣，不利于移植细胞存活，慢性期则胶质瘢痕形成造成神经修复困难[36]，因此探寻不同移植时间与SCI疗效的关系至关重要。王颖等[37]根据大鼠SCI后不同时间移植分为3天组、1周组及3 周组，均通过局部注射途径移植1×106个HUC-MSCs。结果显示损伤后1周移植组后肢运动功能恢复最佳，再生血管及神经纤维数目也多于3天组和3周组，星形胶质细胞向正常形态发展，并且病损处胶质瘢痕减少。陈胜等[38]比较SCI大鼠不同时间移植干细胞的结果亦支持上述结论，陈胜等分别在大鼠SCI后3天、1周及3周于局部病损处注射移植1.2×106个HUC-MSCs。术后各组BBB评分提高，酶联免疫吸附法检测发现IL-2降低，IL-10增加，苏木精- 伊红染色提示损伤局部病理化程度减轻，并且以1周移植组恢复最佳，但人体解剖、损伤病理生理等与动物有较大差异，临床患者适宜移植时间需要进一步探索，而且临床多为慢性SCI患者，当错过最佳移植时间应如何针对性调整治疗方案以实现个体化治疗仍需深入研究。

五、HUC-MSCs治疗SCI临床应用

随着干细胞技术水平不断发展进步和动物实验成效的鼓舞，HUC-MSCs移植逐渐应用于临床，至今有15篇文献报道HUC-MSCs治疗SCI患者的疗效观察[39-53]。

Cheng等[39]取足月健康新生儿脐带来源的HUC- MSCs培养至第6 ～ 8代后制备成浓度为4×105个/μl细胞悬浮液，行局部移植治疗病程在1年以上胸腰段慢性SCI患者。HUC- MSCs移植组10例患者CT引导下病灶处移植2 次 50 μl的细胞悬液，间隔 10 d，移植细胞数为 4×107，异体移植未行抗免疫排斥处理；康复组14例患者仅行康复理疗。术后6个月使用美国脊髓损伤神经功能评分标准，日常生活活动能力评分，尿动力学等评价疗效。结果干细胞组10例患者中有7例患者在感觉运动，自理能力，排尿功能方面有改善，所有患者未出现免疫排斥反应，仅有1例出现放射性神经痛，可能与局部移植针刺有关，而康复组的改善恢复差异无统计学意义，证明干细胞临床应用是安全有效的。张赞等[40]将受伤1 ～ 3年的30例慢性脊髓损伤患者分为两组，观察组15例SCI患者局部病损处移植来源于新生儿脐带的HUC-MSCs，细胞浓度为8×105个/μl，异体移植未做抗免疫排斥处理；对照组15例患者行常规康复治疗。6个月后，与术前及对照组相比，观察组痛觉评分、触觉评分、运动评分、损伤分级均有改善，另外观察组术后不良反应出现发热7例，低颅压症状2例，腰腿痛4例，但症状均较轻，对症处理后消失，未出现感染，脑脊液漏等并发症，表明干细胞移植是安全的。刘静等[41]长期随访观察（平均84个月）35例慢性SCI患者（平均病程56个月）鞘内移植HUC-MSCs的疗效与安全性，每周1次注入10 ml剂量为1×106个/kg的HUC- MSCs悬液，1个疗程为4周，异体移植未行抗免疫排斥处理。结果25例不完全SCI患者中22例在轻触觉、针刺觉、运动和日常生活活动能力评分均有提高，有效率达88%；另外10例完全SCI患者未有改善。术后有2例患者出现轻微低颅压症状，考虑与腰穿有关，对症处理后消失，未有与免疫排斥相关事件出现。另外Zhao等[42]将HUC-MSCs联合一种新型胶原蛋白NeuroRegen支架用于临床治疗平均病程13.4个月的慢性SCI患者。首先显微手术切除8例慢性完全性SCI患者的神经瘢痕组织，然后将装载4×107HUC-MSCs的NeuroRegen支架植入切除部位，异体移植未行抗免疫排斥相关处理。术后随访1年患者感觉水平和运动诱发电位反应区域增加，手指活动性增强，排便感觉和自主神经功能改善未观察到任何不良反应。NeuroRegen支架可桥接损伤区域并抑制胶质瘢痕组织再形成，干细胞黏附在纤维上的多个微小通道以减少植入过程的扩散丢失，并且沿着纤维引导轴突生长，提示联合生物材料支架装载HUC-MSCs是一种潜在的治疗慢性SCI方法。

六、总结与展望

随着干细胞制备过程逐渐成熟，体外培养分化方法不断改进，神经修复机制初步阐明，并在移植途径、移植时间、联合治疗、临床应用有效性和安全性等方面进行深入探索，使干细胞治疗SCI的效果提高。尤其是联合治疗策略克服各种单一治疗的劣势，充分发掘各组分之间的协同作用，在SCI修复中呈现出巨大的潜力。

虽然HUC-MSCs移植治疗SCI进步较快，但依然面临许多问题。首先，联合治疗种类繁多，干细胞联合移植各组分之间应寻找最佳搭配组合方案以发挥最大效应；其次，目前临床治疗均为样本较小的RCT和病例对照试验，仍需大规模多中心的RCT验证，并且当前随访时间普遍仅有3个月～ 1年，而干细胞临床治疗的有效性及安全性需要长期监测；然后SCI不同类型不同阶段，完全性损伤、不完全性损伤、急性期、慢性期具有不同特点，如何调整治疗方案以实现个体化精准化治疗有待探索。

未来应着重于干细胞各项技术的规范化和标准化，提高体外培养分化效率，进一步阐明神经修复机制，继续相关信号分子、传导通路等基础研究，并反复实践不同治疗策略以建立一套综合治疗方案体系，为干细胞在临床上大规模应用奠定坚实的基础。