脑外伤干细胞治疗进展

卢子明，陈桂增，罗灼明 （东莞市人民医院神经外科，广东东莞523059）

0 引言

颅脑损伤（traumatic brain injury，TBI）是一种常见的多发病，根据世界卫生组织的推测，到2020年后，颅脑损伤将成为影响人类健康及导致残疾的主要原因，其给患者家庭及社会带来了沉重的经济负担［1］。TBI是由外伤引起正常脑功能的破坏，其可导致严重的身体、认知及情感障碍。TBI的病理生理学主要包括血脑屏障（blood brain barrier，BBB）的破坏、广泛的神经炎症、弥散性轴索损伤以及神经退行性病变［2］。脑损伤的病理变化主要是组织结构缺失、神经细胞的破坏及内环境紊乱，而神经细胞的破坏是其关键环节，现尚无有效的药物治疗方法［3］，目前主要的治疗方法有高压氧、无创性脑刺激、任务导向功能电刺激及行为治疗等［4］。

近年来，有研究［5］发现多种干细胞可治疗创伤性颅脑损伤后的神经功能损伤，如间充质干细胞（mesenchymal stem cells， MSCs）、神经干细胞（neural stem cells， NSCs）、多潜能成体祖细胞（multipotent adult progenitor cells， MAPCs）及内皮祖细胞（endo⁃thelial progenitor cells，EPCs）等。本文就近年来不同类型的干细胞治疗脑外伤的作用和进展、主要不足之处及相关机制进行相关文献综述。

1 不同类型干细胞的治疗效果

1．1 MSCs MSCs是一种异质性的多能成体细胞，可以从骨髓、脂肪和血管周围组织等部位分离出来［6－7］，具有定向分化为间充质及非间充质组织的能力，也包括神经细胞［8］。MSCs在组织再生方面起着非常重要的作用，其可通过抑制炎症、分泌营养因子（即旁分泌效应）、募集局部祖细胞来替换丢失的细胞，从而促进受损组织的再生［9］。 有研究［10］表明MSCs可通过旁分泌的方式下调炎性蛋白的表达，加速颅内动脉瘤的修复作用。

有研究［11］发现，MSCs除了具有分泌能力外，其可选择性迁移到大鼠TBI模型的损伤脑组织中，随后分化为神经元和星形胶质细胞修复受损脑组织，从而改善TBI模型运动功能。Zhang等［12］利用TBI大鼠模型研究MSCs的抗炎症反应和免疫调节的特性，与对照组相比，MSCs治疗组中TBI动物的神经功能在3～28 d得到明显改善，而MSCs治疗组的受损脑组织含水量也显著下降，但在脑损伤后72 h时，MSCs治疗组和假手术组的脑组织含水量之间没有显著性差异。除此之外，他们还发现MSCs治疗可减少损伤皮质中小胶质细胞或巨噬细胞、中性粒细胞、CD3＋淋巴细胞、凋亡细胞及促炎性细胞因子，从而抵抗受损脑组织的炎症反应［12］。 相似的，Guo等［13］通过向TBI小鼠模型注射骨髓源性MSCs进行研究，与对照组相比，MSCs治疗可促进TBI小鼠神经功能的恢复，改善学习和记忆障碍，减少神经细胞凋亡，其机制可能是MSCs促进TBI小鼠脑组织VEGF和Ang⁃1的表达及微血管的生成。除了单纯将MSCs回输至体内治疗TBI，通过在体外过表达某种基因，从而达到增强MSCs增殖、抗氧化应激等作用的目的，然后再回输至TBI模型体内也是治疗 TBI的一种好方案。SOD2在抗氧化应激中发挥非常关键的作用，Shi等［14］通过将过表达SOD2基因的MSCs经静脉回输至TBI小鼠中，发现其可减弱TBI小鼠的神经炎症反应，维持BBB的完整，并且可加速TBI小鼠神经功能的恢复。

尽管有基础研究［15］证实MSCs可改善TBI的神经功能及预后，但MSCs大量应用于临床还是有很大的难度，因为MSCs的治疗存在促进脑肿瘤生长的可能。截止目前，已经有两项关于MSCs治疗TBI的疗效及安全性的临床研究。在其中的一项临床研究［16］中，有7名颅脑外伤患者在颅脑手术中接受MSCs移植，术者将MSCs直接应用于损伤脑组织中，然后将108～1010个MSCs经静脉回输至TBI患者体内；在术后6个月的随访中，患者的神经功能明显改善，并且没有发现相关毒性迹象，但该研究的不足之处是样本量太少，并且无对照组。而第二项临床研究［17］则共纳入了10例重度颅脑外伤患者进行Ⅰ期临床试验，MSCs主要通过静脉注射或鞘内注射，神经功能是否得到改善主要由NIHSS量表、GCS评分及GOS评分评定。在细胞移植细胞后，血清中的神经生长因子及脑源性神经营养因子明显升高，并且在随访中，患者的神经功能都得到了不同程度的改善，并且无死亡或不良事件发生，这为MSCs治疗TBI的安全性和可行性提供了大量支持。但可惜的是，本项临床研究与前面提到的临床研究类似，其主要的不足也是样本过小及无对照组。

虽然MSCs在基础和临床研究上都取得了不错的治疗效果，但其不能在TBI模型上长时间存活及可能存在免疫排斥反应也是一个值得继续深入研究的问题［18］。目前，细胞替换和长期移植介导的营养支持或免疫调节是MSCs的主要作用机制，但细胞存活率低、免疫排斥反应及不能量化细胞存活率可能会影响准确评估细胞对TBI的长期修复和恢复神经功能的能力［19］。

1．2 间充质干细胞源性外泌体 外泌体是一种包含了各种RNA（mRNAs、miRNAs等）及蛋白质、直径为30～100 nm的小膜泡，其可来源于正常及病理状态下的多种细胞［20］。外泌体具有重要的临床价值，比如其表面标志物及分子可作为一些疾病潜在的诊断性标志物［21］，其不仅具有低免疫性及在外周循环中半衰期较长的特点，而且还具有穿过血脑屏障的能力［21］。与其它类型的细胞相比，MSCs能够产生大量的外泌体，并且提取出的外泌体在形态特征、分离及储存方法上与其它细胞来源的外泌体并没有明显差别［22］。

除了将MSCs通过不同途径移植至TBI动物模型体内进行治疗，Zhang等［23］通过从MSCs提取外泌体，然后将外泌体蛋白通过尾静脉回输至TBI动物模型中，发现外泌体治疗组中TBI大鼠的神经功能可得到显著改善，其机制可能与外泌体促进内源性血管生成和神经发生，减轻TBI后炎症反应有关。接着，他们又通过对比二维与三维胶原支架培养的外泌体在治疗TBI疗效上的差异，发现三维胶原培养的外泌体在改善TBI后神经功能恢复及空间学习能力方面的效果更好［24］。 类似的，最近的一项研究［22］利用小鼠TBI模型进行研究，发现经MSCs源的外泌体治疗后可减轻TBI后认知功能的损害。除了MSCs源性外泌体可改善TBI功能，Xin等［25］发现外泌体也可显著促进大鼠脑卒中模型神经功能的恢复，进一步研究发现，与对照组相比，外泌体治疗可显著增强脑卒中模型中神经轴突重建、神经发生和血管生成。

与移植外源性干细胞相比，MSCs源性外泌体移植在修复受损脑组织上具有以下几个优势：（1）不存在伦理问题；（2）侵袭性较小；（3）较低或无免疫原性；（4）较低或无致瘤性［26］。

目前，国内外研究中尚未有关于MSCs源性外泌体治疗TBI的临床研究，因外泌体治疗TBI的具体机制仍尚未完全清楚，所以对其修复TBI后受损脑组织的具体机制的研究是其应用于临床的必要步骤。

1．3 NSCs NSCs是一种具有自我更新能力，可进一步分化为神经元、胶质细胞及少突胶质细胞的干细胞。由于宿主的免疫排斥反应，人类细胞移植至TBI动物模型中长期存活是很难实现的，Haus等［19］则通过制作一种新的具有免疫缺陷的TBI大鼠模型，并将人NSCs移植至该模型中，并长时间（大于或等于2个月）观察脑损伤后认知功能的恢复，发现9%～25%的NSCs被移植至TBI模型中至少存活了5个月，并且可分化为成熟的神经元、星型胶质细胞及少突细胞；该研究提示移植人NSCs可能是一种有效的、可长期治疗脑损伤后神经功能恢复的方法。此外，通过转染携带促进生长的相关基因从而增强NSCs的增殖、分化等功能，然后将该NSCs移植至TBI模型体内也是治疗TBI的一种有效方法。在Philips等［27］的研究中，向TBI模型注射已转染携带神经生长因子基因的病毒的NSCs可明显提高海马区锥体细胞存活率，并且TBI模型认知、学习能力及运动神经功能也得到明显恢复。目前，主要通过立体定向注射和侧脑室注射两种方法移植NSCs至TBI动物模型中，而通过侧脑室注射的NSCs在体内存活率更高［28］。除了NSCs移植的方法，移植的时间也是影响NSCs治疗TBI效果的关键因素，TBI后两天及一周内注射NSCs的疗效明显比两周后的好，而TBI后一个月才使用NSCs进行治疗则对TBI模型的运动及认知功能的恢复无明显效果［29］。

目前，NSCs应用于临床试验主要受限于NSCs难以大量培养、生产。最近，有一项关于利用人NSCs治疗慢性颈脊髓损伤的临床研究［30］，虽然该研究发现经NSCs治疗后神经功能总体上得到了恢复，但仍需增加样本及对照组方能进一步明确其疗效。

1．4 MAPCs MAPCs在 2002年被首次报道，因其具有可分化为间充质细胞、脏壁中胚层、神经外胚层及内胚层的特点而备受关注，且其分化潜能并不会因持续增殖而丢失［31］。MAPCs是一类与MSCs明显不同的细胞群，因为MAPCs的MHC I型表面蛋白表达量较低，并且其具有更强的分化为内皮细胞的能力［32］。截止目前，只有国外的一个研究团队利用SD大鼠［33－34］及小鼠［35］模型研究人类 MAPCs 治疗 TBI，他们分别于TBI后2 h及24 h经静脉向TBI模型注射106个MAPCs，发现MAPCs治疗脑外伤120 d后可改善其空间学习、信息保持、记忆检索和运动障碍能力，并且可维持脑外伤急性期血脑屏障的完整［36］，其主要机制可能是通过上调抗炎症反应因子的表达来对抗损伤引起的炎症反应［33］。

1．5 iPSCs iPSCs最早于2006年被报道，是由两位日本科学家利用病毒载体将转录因子Oct3／4、Sox2、c⁃Myc和Klf4转入已分化的体细胞中，使其重编程而得到的类似胚胎干细胞的一类细胞［37］。此类细胞可从患者提取，然后在体外经重编程生成iPSCs，再回输给患者本人，从而避免了伦理问题及免疫排斥反应，其具有自我更新及分化为各类细胞的能力，因此有很好的临床应用前景。

最近，Cary等［38］通过取一位脑外伤后患有严重认知功能障碍的患者的硬脑膜，然后从中提取成纤维细胞，最后通过转染携带非整合的仙台病毒后可获得iPSCs。对于需要手术的脑外伤患者，取硬脑膜进行培养是获取iPSCs的很好的途径。Kobayashi等［39］利用脊髓损伤狨猴模型进行研究，作者发现移植的人源的iPSCs可在动物体内存活并且可分化为三种神经细胞系，可促进轴突再生，而且还具有防止脑组织损伤的神经保护功能。Gao等［40］利用逆转录病毒将四个转录因子 Oct4、Sox2、Klf4和 c⁃Myc及反应性胶质细胞重编程至iPSCs，发现此类iPSCs可分化为大量的NSCs，并且可进一步分化为神经元及胶质细胞，从而修复TBI受损脑组织。Lyu等［41］利用TBI模型进行研究，发现iPSCs源性A2B5＋细胞移植至脑损伤区后可有效改善神经功能障碍，其机制主要与lncRNA和mRNA的表达变化有关。相似地，Wei等［42］和Dunkerson等［43］利用动物TBI模型进行研究，也发现iPSCs移植治疗可显著改善TBI后认知及运动功能。iPSCs除了可促进外伤后神经功能的恢复，还可作为治疗亨廷顿病的重要选择。An等［44］利用人亨廷顿病细胞模型进行研究，并从亨廷顿病患者中提取成纤维细胞重编程最终获取iPSCs，发现iPSCs可改变亨廷顿病细胞模型的表型，且可进一步分化为纹状体神经元。

虽然 iPSCs有许多优点，但是也存在很多不足［45］。首先，由于这种细胞是由病毒的感染而重编程生成的，其具有一定的致瘤性，并且其由体细胞重编程生成的效率较低。再者，因为这种由再编程生成的细胞具有未知的遗传和表观遗传背景，所以在临床中使用iPSCs之前需要仔细评估其安全性问题。

1．6 EPCs EPCs是血管内皮细胞的前体细胞，主要存在于骨髓中，是一种具有游走特性，能进一步分化为血管内皮细胞的祖细胞，可参与胚胎期血管生成和出生后血管新生。在生理或病理因素刺激下，EPCs在某些趋化因子和粘附分子的作用下可从骨髓动员进入外周血，自发地向内皮损伤的部位募集，参与内皮修复［46］，尤其是发生脑外伤后［47］。

外周血EPCs数量的变化可作为BBB是否被破坏的标志［48］。此外，EPCs在 TBI后24 h内显著升高，而外周血中EPCs数量相对较低的TBI患者可提示该患者预后相对较差［49］。BBB主要由脑血管微血管内皮细胞组成，Boyer⁃Di等［50］研究发现某些特定条件可诱导EPCs向BBB方向分化。内皮细胞集落形成细胞（endothelial colony⁃forming cells， ECFCs）又称“晚期内皮祖细胞”或“内皮外向生长细胞”，是EPCs的一种亚型，最早由Lin等［51］报道。在脑损伤模型中，通过脑室注射脐带血源的ECFCs发现其可归巢至脑损伤区域参与BBB的修复并增强新生血管生成［52］。激活Notch通路可增强EPCs的迁移及管腔形成能力，而通过激活TBI动物模型体内EPCs的Notch通路则可促进受损脑组织血管的形成及脑组织的修复［53］。为了追踪EPCs在损伤脑组织中分布，明确EPCs是否的确迁移至受损脑组织参与修复，有学者利用GFP及BrdU双标记EPCs，从而发现经静脉注射后的EPCs可归巢至损伤脑组织，促进海马神经发生及血管再生，并可显著改善TBI后的神经功能［54］。 Xue等［55］则通过从脂肪组织中分离培养出EPCs进行研究，发现EPCs可聚集在损伤脑组织并参与毛细血管形成，并且可减少星型胶质细胞增生及减轻炎症反应。相似的，Chen等［56］分别于创伤性脑损伤后6 h及12 h后分别向TBI模型注射经SPIO标记的EPCs，发现在1周后受损脑组织区域脑血液灌注恢复及微血管明显增加。因外周血中EPCs数量极少，所以通过体外EPCs移植可能是促进创伤性脑损伤患者神经发生和神经功能恢复的一个有效方法。此外，通过外源性药物增强外周血EPCs的迁移能力及管腔形成能力，也可促进TBI后神经功能的恢复，如促红细胞生成素［57］及孕激素［58］。

TBI后脑白质是否减少是影响患者生存和预后的重要指标［59］。血管可为轴突的生长和发育提供结构性支撑，同时也起着运输氧和清除代谢废物的作用。鉴于血管细胞在轴突发育及体内平衡中发挥着重要作用，因此有学者推测EPCs在脑发生病变时其起着介导病变局部血管生成的作用，并利用TBI动物模型进行研究，证实了EPCs可维持TBI后脑白质的完整性及减少毛细血管的破坏［60］。

目前，虽然大量的基础实验证实EPCs移植治疗可显著改善TBI后神经功能，但是其疗效及安全性仍有待进一步的临床研究。

2 结论与展望

尽管目前在创伤性脑损伤方面，无论是病理生理学的复杂性还是干细胞疗法在治疗中的应用方面，都进行了大量的基础研究，但仍有许多问题亟待解决，以确定促进脑功能组织恢复的最佳方法。虽然目前已经有干细胞治疗TBI后脑损伤的临床研究，并且均取得了良好的治疗效果，但样本量尚不够大，而且缺乏对照试验。因此，所有可能影响TBI治疗效果的研究和干预措施都需要进行多中心的长期随访和随机前瞻性试验，这将对我们能否为不同TBI人群制定合适的治疗方案产生巨大的影响及起着非常重要的作用。尽管大量的基础研究证实干细胞治疗颅脑损伤有较好的效果，但是干细胞的安全性、注射途径、注射时间及具体的机制等问题都是影响干细胞能否应用于临床关键的因素，也是以后研究的重点。