奶牛乳房炎实验室诊断技术研究进展

李德芬，朱俊平

（1．山东省寿光市上口镇畜牧兽医管理站，山东 寿光 262700；2．山东畜牧兽医职业学院，山东 潍坊 261061）

奶牛乳房炎又叫奶牛乳腺炎，是乳腺受到物理、化学、微生物学刺激所发生的一种炎性反应。奶牛乳房炎不仅使奶牛产乳量下降，降低生鲜乳和乳制品的质量，还由于在临床治疗过程中盲目使用抗菌药，导致乳中药物残留升高，污染环境且危害人类健康［1，2］。及时而正确诊断乳房炎成为防治奶牛乳房炎的关键。

1 加州乳房炎检测法／兰州乳房炎检测法

加州乳房炎检测法／兰州乳房炎检测法（CMT／LMT）基本原理是用一种阴离子表面活性物质—烷基或烃基硫酸盐，破坏乳中的体细胞，释放其中的蛋白质，蛋白质与试剂结合产生沉淀或凝胶。乳中体细胞越多，产生的凝胶也就越多。该方法操作简单，易于掌握，在临床中经常使用，但结果受年龄、季节等多种因素的影响。

CMT法具体操作步骤是先将2 mL被检乳置于塑料乳房炎检验盘中，再加入2 mL CMT试剂（试剂配方：烷基硫酸钠 30～50 g，苛性钠 15 g，溴甲酚紫0．1 g，蒸馏水 1 000 mL），缓慢以同心圆状搅拌 10 s。然后根据乳汁的颜色与状态判定结果：乳汁无变化，不出现凝块判为阴性（－）；乳汁出现微量沉淀，不久就又消失的倾向为可疑（±）；乳汁部分形成凝胶状为弱阳性（＋）；乳汁全部呈凝胶状，在回转摇动时，凝块向中央集中，一旦停止摇动，凝块呈凹凸状附于皿底为阳性（＋＋）；乳汁全部呈凝胶状，回转摇动时凝块向中央集中，停止摇动时仍保持原状，并固着于皿底为强阳性（＋＋＋）；乳汁变为黄色意味着细菌增多，乳糖被分解，乳样呈酸性；乳汁呈深紫色则乳样呈碱性［3］。

2 乳汁体细胞计数（SCC）法

每毫升牛奶中含有细胞的数目即为体细胞数（SCC）。在正常的生理状况下，每毫升牛奶中有2万～20万个体细胞。当奶牛的泌乳系统受到不同种类细菌的侵袭而发生感染及损伤时，通过机体的免疫机制，承担排除感染与修复任务的白细胞就会在此集聚，该乳腺组织分泌的乳汁中体细胞数量随即大幅度上升，这样，就可通过对乳汁中SCC的变化来判断是否是隐性乳房炎。大量试验表明，当牛乳中体细胞数达 5×105个 ／mL 时，即存在乳房炎隐患［4］。 但体细胞的数量受年龄和胎次、泌乳期、季节、机体应激、个体特征以及挤奶操作等因素的影响。

目前，检测牛乳中体细胞数的方法有多种，主要有体细胞直接计数法、电子计数法、荧光电子细胞计数法等。

2.1 体细胞直接计数法

该法检测结果最为准确，常作为其他方法的对照。一般认为每毫升乳汁中细胞数超过50万定为乳房炎，有的则认为超过25万即可定为乳房炎［5］。但是，中国农科院中兽医研究所根据试验提出在治疗乳房炎判定疗效时，每毫升乳汁中细胞数降至100万以下就可定为正常，国外也有类似的报道。

2.2 电子计数法

首先将乳细胞在试管中进行染色，然后用0．65 μm的微孔滤器将染好色的乳汁滤过，使细胞集于滤器上。滤器油浸处理后进行检查。这种方法操作比较简单快捷，是一种较为先进的方法。

2.3 荧光电子细胞计数法

首先将乳样用缓冲液稀释并与一种染色剂混合、涂片，然后置于有转盘装置的显微镜上，当转盘经过物镜时，即可将荧光细胞的数目自动记录下来。全部操作均为自动化，迅速便捷，每小时可计数180个乳样。

3 乳汁中细菌的分离培养与鉴定

取采集的奶样5 mL置于灭菌离心管中，3 000 r／min离心10 min，弃去离心管中的上层液体，吸取0．1 mL沉淀物分别接种于普通营养琼脂和绵羊血琼脂平板，置37℃温箱中培养24～48 h。观察菌落形态、生长特征，并进行革兰氏染色镜检［6］。

将符合链球菌形态特征的菌株接种于改良爱德华培养基，将符合葡萄球菌形态特征的菌株接种于绵羊血琼脂平板，将符合革兰氏阴性杆菌形态的菌株接种于麦康凯琼脂培养基和S－S琼脂培养基，初步判定细菌种类，并纯化培养，将纯培养物保存于试管斜面培养基内。根据初步鉴定结果对分离到的菌株有选择地进行生化试验，接下来通过致病性试验、药敏试验得出细菌较敏感的药物，供临床治疗参考。

细菌培养诊断法专属性强，能准确得出致病菌敏感的药物，便于临床使用，但细菌培养法需要较长的时间。

4 乳汁pH检测法

患乳房炎的牛乳汁pH呈碱性，pH随着体细胞和炎性细胞数量的增加而变大，正常乳汁的 pH在6．4～6．6；乳中体细胞数在 20 万～50 万／mL 时，乳汁pH 在 6．6～6．8；乳中体细胞数在 50 万～500 万／mL时，乳汁 pH 在 6．8～7．2；乳中体细胞数大于 500 万／mL时，乳汁pH在7．2以上。因此，利用牛乳汁pH的变化，可以间接地诊断出奶牛乳房炎及其发病的程度［7］。

通常使用的方法有溴麝香草酚蓝（BTB）法和乳房炎试纸法。利用BTB滤纸片可快速诊断，操作简单，检测迅速，灵敏度较高，但当牛乳被掺入碱性物质后检测效果不理想。

5 电导率值检验法

电导率检测法是依据机体血浆与乳的渗透压相等，健康奶牛乳汁渗透压大部分是由氯化钠和乳糖形成。发生乳房炎时，血－乳屏障的渗透性改变，Na＋、Cl－进入乳汁，使乳汁电导率上升，此方法能迅速、准确的检测乳房炎。国内外的专家学者在这方面做了大量工作，推出了很多通过乳汁导电性增强的原理来检测隐性乳房炎的仪器。新西兰生产的AHI乳房炎监测仪仅能显示隐性、阳性和可疑，但不能显示炎症的轻重程度。国内在这方面做了很多工作，山西农业大学推出SX－I型乳腺炎诊断仪，随之又推出CN乳腺炎诊断仪；西北农林科技大学研制出 XND－A型乳腺炎诊断仪。

6 氢氧化钠凝乳试验法

在乳样中加入氢氧化钠，观察乳汁中是否有凝块来判断是否患有乳房炎。乳汁肉眼观察无异常变化，不透明者为阴性；乳汁出现小颗粒状物者为可疑；乳汁略微透明，有凝乳块形成者为弱阳性；乳汁呈水样透明，有比较大的凝乳块形成者，奶牛已患上隐性乳房炎；乳汁完全透明，全部呈凝乳块状，奶牛患有隐性乳房炎的情况比较严重［8］。苛性钠凝乳试验法操作简单，易于掌握，但试验结果无统一明确的标准，结果易受主观判断影响。

7 PCR诊断技术

目前，PCR诊断已经成熟运用于许多疾病的诊断，在奶牛乳房炎的诊断方面也有深入研究。依据原核生物的rRNA分为 5S rRNA、16S rRNA和23S rRNA，并且位于同一操纵子上。rRNA基因在大多数原核生物中都具有多个拷贝，拷贝数目从1～14个不等。其中16S rRNA序列分析已成为细菌种属鉴定和分类的标准方法，约有2 500种16S rRNA全序列已被报道。根据16S rRNA、23S rRNA在不同种的细菌中拷贝数、长度、碱基排列顺序及含有的tRNA基因的数量和种类不同，可判断致病菌的种群［2］。基本过程类似于传统的PCR，包括乳样的制备、扩增、凝胶电泳。其中无乳链球菌和停乳链球菌特异性引物的设计就是基于编码16S rRNA的DNA序列，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、乳房链球菌是基于编码23S rRNA的DNA序列。PCR检测敏感性高，并可确诊感染的菌株，减少了微生物学诊断的繁琐步骤，省时省力，结果准确可靠，特异性强，是未来研究的方向之一。