灵芝液体深层发酵的影响因素研究进展

任 奕

（本溪化学工业学校，辽宁 本溪 117004）

灵芝是我国传统的药食兼用的大型真菌，其孢子、菌丝和子实体均可被利用，具有祛病延年、滋补强壮的作用。现代研究表明：灵芝多糖、灵芝三萜和灵芝酸是灵芝的主要生物活性，具有抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、抗氧化等功效。近年来，采用液体发酵技术获得灵芝有效成分的研究取得了较大进展，但其发酵过程受多方面因素的影响。在灵芝液体发酵过程中，培养基成分、发酵控制条件、补料方式、紫外线诱变和外源物质添加等因素都会影响灵芝三萜类化合物、灵芝多糖和灵芝酸的产量。目前，国内对于灵芝液体发酵影响方面进行了大量的研究，在查阅收集大量文献的基础上，综述近几年灵芝液体发酵相关研究进展，旨在为灵芝液体深层培养提供参考。

1 菌株筛选条件对灵芝液体深层发酵的影响

汤坤鹏等为筛选灵芝液体深层发酵专用型菌株，以菌丝生物量、三萜、胞内及胞外多糖为评价指标，采用灰色关联度法综合评价。结果表明：在24株灵芝菌株中，HS-2生物量最高达16.44 g／L；三萜含量以菌株 J-16／AL-14 最高（0.33%）；胞内多糖以菌株 H（韩芝）含量最高（10.13%），胞外多糖以菌株 006（16.96 g／L）和 S-1（16.11g／L）最高。此外，灵芝菌丝检测到灵芝酸 C 和 F。以权重分别为生物量 0.4、三萜 0.2、胞内多糖0.2、胞外多糖0.2进行灰色关联分析，菌株006与参考菌株关联度最高，适合作为灵芝液体深层发酵菌株。该研究将灰色关联度法应用于灵芝液体深层发酵菌株筛选，对灵芝工业化液体发酵生产具有参考价值。

2 培养基成分对灵芝液体深层发酵的影响

冯杰等以沪农灵芝1号为供试菌株，以葡萄糖作为碳源，用硫酸铵、氯化铵、鱼粉蛋白胨、胰蛋白胨和酵母粉作为氮源，研究不同种类氮源对灵芝菌丝体液态深层发酵过程的影响。首先，确定以N-10酵母自溶粉作为发酵的氮源，降低了发酵的复杂性和不确定性；其次，考察N-10酵母自溶粉不同浓度对灵芝菌丝体发酵合成灵芝三萜过程中菌丝体的生物量、葡萄糖消耗、灵芝三萜产量等的影响，确定以N-10酵母自溶粉的适宜添加浓度。在此基础上，采用响应面中心组合设计，对4因素最佳水平范围进行研究，结果表明，葡萄糖、N-10酵母自溶粉、磷酸二氢钾和七水硫酸镁的含量分别为 31.06，2.76，1.77，1.99 g／L 时，灵芝三萜的理论产量为21.166 g／kg干菌丝体，实际发酵产量提高到21.153 g／kg干菌丝体。与原工艺相比，新工艺的灵芝三萜产量提高了6.22%。

杨静静研究在灵芝液体深层发酵中，玉米粉对灵芝菌体形态和胞外多糖产量、相对分子质量、单糖组成的影响。发酵过程中，随着玉米粉质量分数增加，灵芝菌球直径逐渐减小，中小型（S型和M型）菌球利于灵芝多糖生产；比较不同质量分数玉米粉发酵获得的多糖相对分子质量及单糖组成。结果显示，玉米粉对灵芝多糖的相对分子质量没有影响，但对灵芝多糖的单糖组成及其比例有很大影响，添加玉米粉发酵获得的灵芝多糖中含有阿拉伯糖和木糖，但是岩藻糖和甘露糖的比例相对减少。

3 发酵控制条件对灵芝液体深层发酵的影响

采用液体发酵法培养灵芝，控制因素较多，如溶氧、温度、搅拌转速、通气量等。

3.1 溶氧控制条件的影响

孙金旭等以灵芝真菌为试材，研究在10 L发酵罐发酵培养好氧型灵芝真菌条件下，溶氧控制条件对生产灵芝酸产量的影响。结果表明：溶氧对灵芝酸的影响较大，高通气量有利于缩短发酵时间，适宜的通气量为0.4 L／min，在此条件下，菌体和灵芝酸的最大产量分别为 8.27 g／L 和 171.26 mg／L；相对初始发酵条件，菌体和灵芝酸最大产量分别提高13.13%和13.28%；相对于低通气量，菌体和灵芝酸达到最大产量的时间缩短12 h。

3.2 通气量控制条件的影响

冯杰等采用5 L搅拌式发酵罐，研究灵芝菌丝体液态深层发酵合成灵芝三萜的扩大培养条件，考察不同条件下的通气量对灵芝菌丝体生长、比生长速率、灵芝三萜合成、比合成速率、还原糖消耗、还原糖比消耗速率、铵根离子消耗、铵根离子比消耗速率的影响。研究结果表明，通气量能够显著影响菌丝体的生长和灵芝三萜的合成，当通气量为8 L／min时，菌丝体合成灵芝三萜的得率和生产强度最高，分别为0.204 g／L 和 0.001 31 g／（L·h），最大菌丝体得率达 8.77 g／L。菌丝体最大比生长速率为0.070 4 1／h，灵芝三萜最大比合成速率为0.025 61／h，还原糖和铵根离子最大比消耗速率分别为 0.562 1／h 和 0.017 11／h。

3.3 氧载体控制条件的影响

冯杰等以灵芝三萜浓度为指标，采用单因素试验对正十二烷的添加量和添加时间进行初步确定，再利用中心组合设计对菌丝体液态深层发酵中的氧载体正十二烷的添加工艺进行优化。结果表明：在发酵的第 25.63 h， 加 29.85 mL／L 正十二烷的灵芝三萜浓度理论值为0.84 g／L；在500 mL摇瓶和5 L发酵罐中验证，得到灵芝三萜的浓度分别为 0.85 g／L 和 0.88 g／L，比对照组分别提高578%和398%。

3.4 变转速策略调控条件的影响

赵娜等在研究灵芝发酵过程中，采用变转速调控策略对振荡发酵阶段进行优化，以期达到高产三萜的目的。振荡阶段的最佳条件为：转速由150 r／min变为100 r／min。该策略与液体静置培养相结合，菌丝体三萜产量高达678.0 g／L，比优化前提高21%。

4 补料方式对灵芝液体深层发酵的影响

补料方式对发酵体系中的生物量提高、底物利用、产物合成有一定的促进作用。

冯杰等用50 L发酵罐进行芝菌丝体液态深层发酵，比较4种补料培养方式对灵芝三萜合成的影响。结果表明，补料可明显促进灵芝菌丝体的生长和灵芝三萜的合成；不同补料方式对菌丝体生长和灵芝三萜合成有不同的影响；采用指数补料方式可获得较高的菌丝体干质量，提高灵芝三萜含量，比传统发酵方式效果好；到达发酵终点时，灵芝菌丝体干质量达到17.68 g／L， 灵芝三萜含量达到 4.58 g／100 g 干菌丝体，分别比分批发酵提高65.70%和100.88%。

5 紫外线诱变对灵芝液体深层发酵的影响

紫外线是一种非电离照射，低剂量时通常不会杀死菌种，只能导致DNA突变，从而引起菌种生理特征和生物性状变化。相比X-射线、γ-射线等电离辐射，紫外线易获得，且对人体健康危害较小，在菌种诱变方面应用广泛。

张帅等采用紫外照射诱导菌种的方法增加灵芝菌丝体的多糖含量。首先，考察不同紫外照射时间和功率对灵芝菌丝体形态、生长速度及多糖含量的影响，发现小功率、短时间的照射有利于菌丝体生长，并可提高菌丝体多糖的含量，而大功率、长时间的照射产生相反的影响。然后，通过正交试验确定紫外照射提高灵芝菌丝体多糖含量的最优条件，即用20 W的紫外灯照射灵芝菌种10 min，灵芝菌丝体多糖含量可达9.57%，比未经紫外照射的提高3.45%，但二者清除·OH和O2-·自由基的能力无明显差异。

6 外源物质添加对灵芝液体深层发酵的影响

在灵芝液体发酵过程中，选择适当的外源物质添加到发酵基质中，使灵芝多糖、三萜类化合物产量增加。常用的外源物质有中药材、中药提取物、脂肪酸、木质素、油酸、茉莉酸甲酯、稀土元素和金属元素等。

赵小瑞等采用振荡-静置两段培养法，以当归、党参、甘草、黄芪4种甘肃道地药材提取物作为激发子，研究灵芝液态发酵过程中细胞生长及产灵芝三萜的变化。结果表明：在一定条件下，当归、党参、甘草、黄芪提取物均能显著促进灵芝细胞生长及灵芝三萜的产生，但四者的有效作用浓度范围不同，当归、党参醇提物质量浓度为20～80 g／L时促进作用良好，甘草、黄芪水提物在质量浓度5～15 g／L时促进作用良好。最佳添加时间分别为当归第2 d，党参、甘草和黄芪均第3 d。发酵罐验证试验表明，4种中草药提取物是有效的激发子，可促进灵芝发酵三萜产量提高，当归添加量为 60 g／L 时，胞外三萜产量可达 964.63 mg／L。

姚强等研究硬脂酸、亚油酸和棕榈酸对灵芝液体发酵的影响。结果表明，3种供试脂肪酸都能促进灵芝菌丝体生物量的积累；硬脂酸有利于灵芝胞外多糖的产生，在添加浓度为1.0 g／L时，胞外多糖量达到（1 066.74±11.27）mg／L，是对照的 3.37 倍；亚油酸利于胞内多糖的合成，在浓度为1.5g／L时，胞内多糖量达到（620.90±7.11）mg／L，是对照的 2.56 倍；另外，亚油酸还对灵芝胞内三萜和胞外三萜量表现出较强的促进作用，在浓度为2.0g／L时，胞内及胞外三萜量分别达到（394.23±10.32）mg／L 和（551.32±6.22）mg／L，分别比对照提高1.13和1.12倍；而硬脂酸和棕榈酸则降低胞内和胞外三萜的量。