建立HPLC法测定侧柏叶中杨梅苷的含量

[摘 要]目的：建立测定侧柏叶中杨梅苷含量的HPLC方法。方法：采用Inertsil-ODS-3（4.6mm*250mm，5m）色谱柱，流动相为：甲醇-0.01 mol/L磷酸二氢钾溶液-冰醋酸（37：63：1.5），流速：1.0 mL/min；柱温：40℃；检测波长：254nm。结果：杨梅苷的线性范围为0.023 mg/mL-0.414 mg/mL，线性良好，r=0.9999（n=5）。结论：该方法简便快捷、精密度高、结果准确。

[关键词]HPLC法；杨梅苷；含量测定。

中图分类号：R284 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2018）01-0115-01

侧柏叶为柏科植物侧柏Platycladus orientalis（L.）Franco的干燥枝梢及叶，性味苦涩、性寒，具有凉血止血的功效，临床上常用于各种内脏出血症。侧柏叶含有鞣质、黄酮及挥发油等化学成分。其中黄酮化合物为其主要成分，在质量标准研究中常以槲皮素和槲皮苷作为品质评价指标成分。我们在对侧柏化学成分研究中首次从侧柏中鉴定出杨梅苷成分，且含量较高。有关侧柏中杨梅苷成分的含量测定尚未见报道，为此我们首次建立了侧柏中杨梅苷成分的HPLC含量测定方法，为丰富和完善侧柏药材质量标准提供科学依据，现将研究结果报道如下：

1 仪器、试剂、供试品和对照品

仪器：Agilent1260型HPLC仪（G1314F型紫外检测器，Agilent ChemStation工作站），安捷伦科技有限公司；Agilent1260型HPLC仪（G1365D型紫外检测器，Agilent ChemStation 工作站），安捷伦科技有限公司；AG285型电子天平，梅特勒公司；超振荡清洗仪（浙江昆山）。

试剂：甲醇为色谱纯（美国天地）；冰醋酸、磷酸二氢钾（国药集团化学试剂有限公司）；水为超纯水。

对照品：杨梅苷购于上海融禾医药科技发展有限公司，批号：090106供含量测定用。

供試品：分别采于陕西省咸阳市、新疆新疆大学校园、浙江省兰溪市、辽宁省沈阳市、重庆市，去净泥沙，尘土和枝条，50℃烘干备用。以上样品经北大医学部王弘副教授鉴定为柏科植物侧柏Platycladus orientalis（L.）Franco的干燥枝梢及叶。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Inertsil-ODS-3（4.6mm*250 mm，5 m）色谱柱，流动相为：甲醇-0.01mol/L磷酸二氢钾溶液-冰醋酸（37：63：1.5），流速：1.0mL/min；柱温：40℃；检测波长：254 nm。在上述条件下：杨梅苷色谱峰与相邻色谱峰分离良好，理论塔板数大于4500，峰形对称，满足含量测定的要求。

2.2 供试品溶液制备方法

取侧柏叶粉末（过二号筛）约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇50mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）40min，放冷后称定重量，加50%乙醇补足减失的重量。滤过，经0.45μm滤膜滤过，即得。

2.3 对照品溶液制备方法

精密称取杨梅苷0.3mg置10mL容量瓶中，加70%乙醇定容至刻度，经0.45μ m滤膜滤过，备用。

2.4 标准曲线制备和线性范围考察

对照品溶液制备：精密称取0.3mg杨梅苷对照品，以70%乙醇定容于10mL容量瓶中，得对照品溶液。取照品溶液1μl、2μl，6μl，10μl，14μl，18μl注入液相色谱仪中，按规定色谱条件测定，记录峰面积。以对照品进样量（Y，mg）为纵坐标，峰面积X为横坐标，进行线性回归，得杨梅苷的线性方程：r=0.9999（n=5），线性范围为0.023mg/mL-0.414mg/mL。

2.5 精密度和稳定性试验

精密吸取标准品溶液10μl，注人液相色谱仪中，连续测定6次，记录峰面积，计算RSD值，结果表明，杨梅苷RSD值为0.91%。说明仪器精密度良好。

精密吸取供试品溶液10μl，分别于0、1、2、3、4、5、6、7、8小时注入液相色谱仪中，记录峰面积，计算RSD值，结果表明，杨梅苷RSD值为0.17%，说明样品在8h内稳定。

2.6 重复性试验

精密称取同一样品共6份，按照供试品溶液制备方法制得供试品溶液，精密吸取

供试品溶液10μl，注入液相色谱仪中，每份样品测定1次，记录峰面积，计算RSD值，考察样品重复性。

结果表明：6份样品重复性试验中杨梅苷RSD值为0.83%，说明该方法重复性良好。

2.7 加样回收率试验

精密称取已知含量的侧柏叶样品粉末5份，分别精密加一定量的杨梅苷对照品，按照供试品溶液制备方法进行处理，并按上述色谱条件进行测定，计算杨梅苷加样回收率。结果，杨梅苷的平均回收率为98.53% （n=5），结果见表1。

以上HPLC含量测定的方法学考察证明：本研究建立的HPLC含量测定方法准确、可行，适用于侧柏中杨梅苷的含量测定。

2.8 样品测定

按照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，取供试品溶液按色谱条件进行测定，以

外标法计算含量，结果见表2。

3 讨论

3.1 侧柏叶中杨梅苷成分具有收缩血管、降血糖、抗氧化、保肝、利胆、抗炎、抗突变、抗肿瘤和镇痛作用，是侧柏中有效成分之一，有关侧柏叶中杨梅苷的含量测定未见报道，本文首次对杨梅苷进行了含量测定，实验结果表明该方法，重复性好，精高，简便快速，本研究为完善和丰富侧柏药材质量标准提供了科学依据。

3.2 本实验分别考察了甲醇-0.3%甲酸，甲醇-0.5%磷酸，与甲醇0.01mol/L磷酸二氢钾溶液-冰醋酸，三种流动相系统，结果表明在甲醇-磷酸溶液-冰醋酸系统中拖尾因子最小，峰形最好。

3.3 由样品测定结果可见不同产地侧柏叶中杨梅苷含量差异较大，其中陕西省咸阳市样品与重庆市样品含量相差近3倍，其含量变化可能与气候、地理位置以及采集时间等因素有关，有待进一步研究。

作者简介

高莉（1992年），女（汉族），本科学历。endprint