糖尿病性视网膜病变基因治疗的研究进展

姚谢怡+许迅

摘 要 糖尿病性视网膜病变（diabetic retinopathy， DR）是糖尿病的最常见微血管并发症之一，是一类可引起严重视力损害甚至失明的慢性、进展性眼部疾病。目前，DR治疗有视网膜激光光凝、局部注射糖皮质激素类和抗血管内皮生长因子类药物等方法，但它们均有局限性和副作用。近年来，随着越来越多的DR相关基因标志物被发现以及基因载体得到优化，一系列体内外实验已显示出了基因治疗在减少视网膜新生血管、保护视网膜血管及神经功能和改变DR相关表观基因修饰方面的作用。基因治疗具有相对长效且副作用小的优势，有望成为DR的新型治疗手段。

关键词 糖尿病性视网膜病变 基因治疗 新生血管

中图分类号：R774.1； R587.2 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2017）23-0015-05

Progress of gene therapy in diabetic retinopathy

YAO Xieyi*， XU Xun**

（Department of Ophthalmology， Shanghai General Hospital， Shanghai Jiao Tong University； Shanghai Key Laboratory of Ocular Fundus Disease； Shanghai Engineering Center for Visual Science and Photomedicine， Shanghai 200080， China）

ABSTRACT Diabetic retinopathy （DR）， one of the major microvascular complications of diabetes mellitus， is a chronic and progressive sight-threatening ocular disease. Currently， the treatment of DR including laser photocoagulation， intravitreal injection of corticosteroid and anti-vascular endothelial growth factor agents has its limits and adverse effects. A number of studies have shown that the gene therapy can play an important role in retinal angiogenesis inhibition， vascular and neuronal protection and epigenetic modification related to DR with the identification of genetic biomarkers of DR and the optimization of different gene vectors. Gene therapy， which has a longer duration of therapeutic effect and potentially fewer adverse reactions， is expected to be a novel method for the treatment of DR.

KEY WORDS diabetic retinopathy； gene therapy； neovascularization

糖尿病性視网膜病变（diabetic retinopathy， DR）是糖尿病的最常见微血管并发症之一，是一类慢性、进展性的眼部疾病，已成为工作人群失明的首要原因。在罹患2型糖尿病>20年的患者中，>60%的患者会出现不同程度的视网膜病变[1]。随着全球糖尿病患者数持续增加，DR的患病率也随之升高。据估计，到2050年，单在美国>40岁人群中就将有1 600万人出现DR的临床表现，其中300多万人将遭受严重视力损害，给社会及经济带来沉重的压力[2]。

1 发病机制和治疗现状

DR的发病机制至今仍未得到完全阐明，现认为主要与晚期糖基化终末产物的堆积、多元醇通路的激活、氨基己糖通路的激活、蛋白激酶C通路的激活和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶的激活相关。上述通路的激活均会最终导致氧化或硝化应激、慢性炎症反应、微血管和线粒体功能障碍，促使DR发生和发展[3]。此外，视网膜神经元损害和胶质过度增生也与早期DR的发生相关[4]。

由于发病机制复杂，目前治疗DR的方法，如视网膜激光光凝、局部注射糖皮质激素类和抗血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）类药物、玻璃体切割术等，均有局限性和副作用。近年来受到极大关注的抗VEGF类药物虽可显著改善DR患者的视觉，但由于半衰期短、需重复注射以维持疗效，因此会引起一系列的注射相关并发症，包括眼内炎症反应、眼出血和眼压升高，甚至导致更严重的眼内炎[5]。抗VEGF类药物治疗的长期疗效现也尚未得到明确，且随着VEGF的水平下降，可能出现视网膜神经退行性变、脉络膜毛细血管萎缩等情况。此外，并非所有DR患者均对抗VEGF类药物治疗敏感，临床试验显示雷珠单抗0.3 mg治疗仅能使34% ～ 45%的糖尿病性黄斑水肿患者的视觉获得显著改善[6]，而应答的不一致性可能与VEGF基因的多态性相关[7]。因此，临床上仍迫切需要有新的、更有效的DR治疗药物和方法。

近年来有关DR的基因研究逐渐深入，主要包括候选基因研究、基因连锁分析和全基因组关联研究等，期望通过这些研究来寻找并解析不同的基因和单核苷酸变异、基因多态性与DR的易感性及其进展之间的关联。随着抗VEGF治疗已逐渐成为新生血管性眼病的主要治疗方法，VEGF基因的多态性得到广泛研究，而另一些特定的候选基因如醛糖还原酶、内皮型一氧化氮、晚期糖基化终产物受体和促红细胞生成素基因中的单核苷酸变异亦被发现在DR的发病机制中起着一定的作用[8]。endprint

2 基因治疗的研究进展

基因治疗是指用正确的、正常的核苷酸序列替代患者机体细胞中引起疾病的有缺陷的基因中的核苷酸序列，借助基因置换、基因修正、基因修饰和基因灭活等手段来纠正或补偿致病基因，进而达到临床治疗目的的一种治疗方法。在基因治疗中，选用合适的载体将外源基因导入靶细胞非常重要。目前，基因转移技术主要包括病毒依赖和非病毒依赖两种方法。常用的病毒载体包括腺病毒相关病毒（adeno-associated virus， AAV）、腺病毒、慢病毒和单纯疱疹病毒等，其中AAV具有宿主范围广、能转染非分裂细胞、免疫原性低、可在体内持续表达和安全、无致病性的优点。在眼部疾病的基因治疗中，几乎半数临床试验选用的载体均是AAV。作为唯一一种能有效转染内层视网膜细胞的AAV血清型，AAV-2在DR基因治疗研究中的应用最为广泛[9]。非病毒依赖的基因转移技术则借助现代理化方法将基因导入靶细胞，与病毒载体相比，人工合成的非病毒依赖载体的免疫原性较低，且安全性高。此外，非病毒载体可携带更大负荷量的基因，也更易大量制备。随着材料科学和纳米技术的迅速发展，非病毒载体的基因转移效率正在被慢慢提高，有望更多地应用于基因治疗[10]。

近年来，随着越来越多的DR相关基因标志物被发现以及基因载体得到优化，基因治疗作为DR的一种新型治疗手段正越来越受到关注。目前，DR的基因治疗研究主要着眼于减少DR病程中的新生血管、保护视网膜血管及神经功能和改变DR相关表观基因的修饰三个方面。

2.1 减少视网膜新生血管

促新生血管因子与抗新生血管因子间的失衡是引起视网膜新生血管的主要原因[11]，而视网膜新生血管是DR进展期的主要特征。阻止血管内皮细胞增生、重达促新生血管因子与抗新生血管因子间的平衡是DR基因治疗的一大目标。

2.1.1 拮抗促新生血管因子

作为参与视网膜新生血管和血视网膜屏障损害的关键因子，VEGF是DR基因治疗的一个重要靶点。sFlt-1是VEGF受体-1的可溶性剪接变异体，作为胞外诱饵受体可结合循环中的VEGF和胎盘生长因子，从而产生新生血管抑制作用。在一系列的临床前研究中，sFlt-1均被作为抑制视网膜新生血管的基因治疗靶点，经病毒载体转染其基因片段后，视网膜的新生血管受到显著的抑制[11-12]。此外，VEGF的作用也可在胞内被阻断。Flt23k由Flt-1中的VEGF结合域2、3和内质网滞留信号序列组成，作为一种内感受器可同时阻断VEGF的胞外信号通路并能在胞内降解VEGF[13]。一项近期完成的研究显示，由AAV-2转染的Flt23k可在小鼠眼部通过下调VEGF表达而抑制脉络膜新生血管[14]，但详尽的作用机制还需进一步的研究。

2.1.2 增加抗新生血管因子

除拮抗促新生血管因子外，外源性增加抗新生血管因子也可重达正常的血管形成状态。目前，已获研究的抗新生血管因子包括色素上皮衍生因子（pigment epithelium derived factor， PEDF）、组织金属蛋白酶抑制剂-3（tissue inhibitor of metalloproteinases-3， TIMP-3）、内皮抑素、血管抑素和尿激酶型纤溶酶原激活剂（urokinase type plasminogen activator， uPA）的氨基端片段等[15]。许多研究者在高氧诱导的视网膜病变动物模型中发现，通过在玻璃体腔内注入病毒载体转染的PEDF、TIMP-3、血管抑素、uPA的氨基端片段或内皮抑素等基因均可下调视网膜中的VEGF表达，从而显著减少视网膜新生血管[15]。Haurigot等[16]对同时具有非增殖性DR和视网膜新生血管的小鼠模型的玻璃体腔内注入AAV-2转染的PEDF基因，结果发现单次注入即可获得长效的PEDF表达，由此显著抑制视网膜新生血管、恢复视网膜的正常的血管密度。另一项近期完成的研究也发现，在体外培养的人视网膜色素上皮细胞和糖尿病小鼠视网膜中，使用新型载体pEPito转染可使PEDF的过表达维持长达3个月，且此期间视网膜中的VEGF表达显著降低，由葡萄糖转运蛋白介导的葡萄糖转运显著减少，小胶质细胞的活性及其诱发的炎症反应亦显著减少[17]。

2.2 保护视网膜血管及神经功能

随着对DR发病机制研究的深入，许多研究着眼于防止视网膜血管功能障碍和神经元细胞凋亡或损伤，在DR早期视网膜血管和神经损伤尚不严重时即采取保护性治疗成为DR基因治疗的一个新的切入点。

2.2.1 拮抗补体系统活化

正常的眼内环境中因含有抑制补体系统活化的因子，补体介导的通路均处于静止状态，而在罹患视网膜血管性疾病如DR时，眼内的补体系统会被异常激活，形成攻膜复合体（membrane attack complex， MAC）。在DR的进展过程中，MAC的过度产生一定程度上导致了血管内皮和神经元细胞的凋亡，而阻止MAC的形成及积聚可延缓DR的进展[18]。Adhi等[19]的研究发现，MAC的抑制剂可溶性CD59（soluble CD59， sCD59）具有保护神经元细胞免于损伤、同时维持血视网膜屏障完整性的作用：在鏈脲佐菌素诱发的糖尿病动物模型中，通过玻璃体腔内注入AAV-2/8转染的sCD59基因可减少60%的视网膜血管渗漏；sCD59还可活化视网膜神经胶质细胞，后者能在短期内减少神经节细胞（retinal ganglion cell， RGC）的凋亡，但长期效应未知。

2.2.2 外源性补充神经营养因子

越来越多的研究表明，神经营养因子对视网膜神经元细胞和神经胶质细胞的存活及功能调节起着十分重要的作用。在这些神经营养因子中，脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor， BDNF）是DR进展中最为主要的抗神经元变性的保护因子，在缺氧环境下可增加兴奋性神经递质谷氨酸的摄取，并上调Müller细胞中的谷氨酸转运体和谷氨酰胺合成酶的水平，起到神经保护作用[20]。Gong等[21]的研究发现，与未转染组相比，玻璃体腔内注入AAV转染的BDNF基因可提高糖尿病大鼠RGC细胞的存活率并改善其视网膜功能。endprint

2.2.3 减少氧化应激

氧化应激在DR的发病机制中起着重要的作用。在DR患者中，除一系列信号通路改变引起的活性氧自由基（reactive oxygen species， ROS）产生增加之外，抗氧化酶的活性及表达也显著降低[22]。其中，锰超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase， MnSOD）是线粒体中的一种关键抗氧化酶，可将ROS转变为能自由跨越线粒体膜的过氧化氢，从而减轻氧化应激。在糖尿病动物模型中，通过AAV转染MnSOD基因可上调视网膜中的MnSOD水平及活性，从而显著改善基底膜的厚度，并减少视网膜血管内皮细胞和周细胞的凋亡、减少高糖环境导致的氧化应激损害，对糖尿病引起的微血管病变起到重要的预防作用[23]。

2.2.4 其他

血管生成素-1（angiopoietin-1， Ang-1）是血管生成素家族的一员，与血管生成素-2在高糖环境下有血管和神经损伤作用不同，Ang-1是一种血管保护因子，与内皮Tie2受体结合后可减少VEGF的表达及其所导致的钙黏蛋白降解，维持内皮细胞间的紧密连接，从而降低血管的通透性、减少血管渗漏。Cahoon等[24]的研究发现，在Ins2Akita小鼠的玻璃体腔内单次注入AAV-2转染的COMP-Ang1基因可获显著且长效的微血管和神经损伤改善效果。

2.3 改变DR相关表观基因修饰

表观基因修饰在DR的发病机制中起着重要的作用，其可在不改变DNA序列的情况下沉默或激活特定基因位点，从而调节基因的表达。表观基因修饰主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA的作用等，它们在糖尿病患者中均呈活跃状态，且与代谢记忆的发生密切相关[25]。

微小RNA（microRNA， miRNA）在DR相关表观基因修饰中起着重要作用。miRNA是一类小型非编码RNA，可通过与各自的目标信使RNA结合来调节基因的表达。通过收集DR和非DR患者的血清、玻璃体和房水等标本进行检测，一些在DR时表达水平发生显著改变的miRNA已被发现[26]。一些以VEGF为作用靶点的miRNA如miR200b、miR-126、miR-15和let-7家族等可调控靶基因转录后的表达，下调VEGF和其他炎症因子的水平，抑制视网膜新生血管和视网膜炎症反应，为DR治疗研究提供了新的方向[27-29]。另外，一些与核因子-κB通路应答相关的miRNA如miR146、miR155、miR132和miR-21等在DR的发病机制尤其是炎症反应中也起着重要的作用[28]。这些研究结果均表明，miRNA是DR的重要生物标志物，可作为DR治疗的新靶点。

3 基因治疗的挑战与展望

近年来，对恶性肿瘤等疾病，基因治疗已逐渐步入临床研究阶段。眼部结构小且封闭，仅需相对低量的载体就能进行治疗性基因转染，加之血视网膜屏障的存在使得载体进入全身循环的量很少，形成了一个相对免疫豁免的环境，眼部成为基因治疗相对理想的器官。随着对DR相关基因背景研究的逐渐深入，越来越多的与DR相关基因标志物被发现，一系列体内外实验结果均显示出基因治疗在DR中的潜在作用。

不过，基因治疗必须考量载体的安全性与稳定性，且治疗过程中可能出现脱靶效应，使得非靶细胞也被转染上外源性基因，从而引发一系列的不良反应，加之DR本身的发病机制复杂，对DR的基因治疗研究现仍停留在体外及动物模型实验阶段，至今尚未进行过有关DR基因治疗的临床试验。DR基因治疗真正走入临床还面临巨大的挑战，而克服阻碍仍主要有赖于基因治疗相关技术的发展，包括提高病毒载体的安全性及有效性、人工合成具有高转染率的非病毒载体和找到更安全、更有效的基因转染方法等，同时继续深入探索DR的发病机制、筛选与DR发生和发展密切相关的目的基因、关注miRNA在DR中的作用，寻找新的基因治疗靶点。此外，一些新技术如CRISPR/Cas9技术的出现也将加快DR基因治疗的发展[30]。目前，一项基因治疗湿性老年性黄斑变性的临床Ⅰ期单中心、随机试验已获得可喜的结果，证实了眼内基因治疗是一种相對长效及安全的治疗方法[31]。相信在不久的未来，基因治疗必会成为DR的新治疗手段之一。

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