免疫组化蛋白标志物在甲状腺乳头状癌组织中的表达

侯卫华，李从洋，孟祥超，刘艳锋，于兵兵，张　萌，王建业，段尚林，胡学信

(中国人民解放军第152中心医院病理科，河南 平顶山 467099)

甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)是起源于甲状腺滤泡上皮的恶性肿瘤，也是最常见的内分泌恶性肿瘤。临床多以甲状腺肿块首先就诊于内分泌代谢科，进而接受后续外科手术治疗。传统病理依据组织学形态进行诊断，主要观察细胞核特征及多级分支的乳头状结构，而有时一些甲状腺良性病变(benign thyroid lesions，BTL)亦可呈乳头状或假乳头状增生，当细胞核的特征不典型时鉴别诊断常会存在一定困难；包裹性滤泡型乳头状癌当细胞核的特征不明显时与滤泡性腺瘤鉴别更是困难。随着现代病理技术的发展，免疫组化技术在病理诊断中应用越来越广，甚至成为肿瘤病理诊断不可或缺的辅助手段。目前用于甲状腺肿瘤的蛋白标志物种类繁多，正确评价各种标志物显得尤为重要。鉴于此，本研究通过对130例PTC和103例BTL进行免疫组化染色并对染色结果结合病理形态学进行分析，探讨临床上常用的免疫组化蛋白标志物在PTC鉴别诊断及预后评估中的价值，为临床提供参考。

1　资料与方法

1.1临床资料选取2010年1月至2015年12月中国人民解放军第152中心医院病理科甲状腺结节存档标本233例。其中PTC患者130例，男42例，女88例；年龄19～72岁，中位年龄45.4岁，≥40岁者79例，<40岁者51例；单个瘤结节83例，多个瘤结节47例；肿瘤最大直径>1 cm者75例，≤1 cm者55例；原发灶有包膜侵犯者53例，无包膜侵犯者77例；伴有中央区和(或)颈部淋巴结转移36例，其余94例未见淋巴结转移；术后病理分期：Ⅰ期60例，Ⅱ期34例，Ⅲ期28例，Ⅳ期8例[1]。BTL患者103例，其中结节性甲状腺肿45例，桥本氏甲状腺炎42例，甲状腺滤泡性腺瘤16例；男56例，女82例；年龄20～72岁，中位年龄46.2岁。2组患者性别、年龄等基本资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法与结果判定所有标本均经质量分数4%中性多聚甲醛固定，石蜡包埋，3 μm厚连续切片，免疫组化采用EnVision两步法，操作步骤按说明书进行。使用已知阳性切片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照，2组标本在同一条件下进行染色。所用一抗为：细胞角蛋白(cytokeratin，CK7、CK8/18、CK19、CK34βE12)、间皮细胞(mesothelial cell，MC)、半乳糖黏附凝集素(galectin-3)、上皮膜抗原(epithelial membrane antigen，EMA)、消化道癌抗原(carbohydrate antigen 19-9，CA19-9)、神经细胞黏附分子(neural cell adhesion molecule，NCAM，又称CD56)、自然杀伤细胞因子(CD57)、甲状腺过氧化物酶(thyroid peroxidase，TPO)、细胞周期抑制蛋白(p27kip1)、细胞周期素1(Cyclin D1)、甲状腺球蛋白(thyroglobulin，Tg)、甲状腺转录因子-1(thyroid transcription factor-1，TTF-1)共15种。免疫组化结果判定：galectin-3定位于细胞质和细胞核，p27kip1、Cyclin D1及TTF-1阳性定位于细胞核，其余抗体表达于细胞质和(或)细胞膜上。染色阳性是指细胞核、细胞质和(或)细胞膜上呈浅黄色至棕褐色。综合判断高倍镜下阳性细胞百分率评分和染色强度评分。按染色强度评分：无染色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。按阳性细胞百分率评分：高倍镜下随机选取5个视野阳性细胞数之平均数为该例阳性细胞数结果，其中≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为2分，>75%为4分。染色强度得分和阳性细胞百分率得分相加，0～1分为阴性(-)，2～3分为弱阳性(+)，4～5分为中等阳性(++)，6～7分为强阳性(+++)，其中后三者均为阳性。

1.3统计学处理采用SPSS 20.0对研究数据进行统计分析，计数数据以率或百分数表示，用χ2检验(必要时连续校正)或Fisher确切概率法进行比较，检验水准为α=0.05。

2　结果

CK19、CK34βE12、MC、galectin-3、CA19-9、CD57、Cyclin D1在PTC组织中的阳性表达率分别为94.6%(123/130)、90.8%(118/130)、88.5%(115/130)、96.2%(125/130)、85.4%(111/130)、95.4%(124/130)、75.4%(98/130)，明显高于BTL的34.0%(35/103)、16.5%(17/103)、10.7%(11/103)、35.9%(37/103)、12.6%(13/103)、18.4%(19/103)、28.2%(29/103)，差异均有统计学意义(χ2=96.797、130.058、140.004、98.404、122.212、143.496、51.695，P均<0.05)；CD56、TPO、p27kip1在PTC组织中的阳性表达率分别为7.7%(10/130)、23.8%(31/130)、32.3%(42/130)，明显低于BTL的91.3%(94/103)、95.1%(98/103)、79.6%(82/103)(χ2=162.410、118.219、51.652，P均<0.05)；CK7、CK8/18、EMA、Tg、TTF-1在PTC组织中的阳性表达率分别为99.2%(129/130)、91.5%(119/130)、86.2%(112/130)、99.2%(129/130)、100.0%(130/130)，BTL组织中分别为99.0%(102/103)、94.2%(97/103)、77.7%(80/103)、100.0%(103/103)、100.0%(103/103)，均高表达(χ2=0.027、0.591、2.853，Tg比较用Fisher确切概率法，TTF-1均为100.0%，P均>0.05)。PTC组织中p27kip1和Cyclin D1阳性表达率与肿瘤有无淋巴结转移[(16.7%vs38.3%，χ2= 5.569，P<0.05)、(100.0%vs66.0%，χ2= 16.257，P<0.05)]及TNM分期(Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期)[(37.6%vs18.9%，χ2= 6.632，P<0.05)、(69.9%vs89.2%，χ2=5.312，P<0.05)]有关，而与患者年龄、性别、肿瘤结节数目、肿瘤直径、包膜侵犯与否均无明显关系(P均>0.05)。其他蛋白与PTC患者的临床病理参数均无明显关系(P均>0.05)。

3　讨论

本研究对临床常用的15种免疫组化蛋白标志物在PTC和BTL组织中的表达和意义进行探讨。按病理生理机制和病理意义的不同简单归类并进行分析阐述。

3.1甲状腺滤泡细胞标志物Tg是由甲状腺滤泡细胞合成的一种糖蛋白，是甲状腺滤泡细胞及其起源肿瘤的最特异性标志物，主要用于PTC或甲状腺滤泡癌与甲状腺髓样癌及转移癌的鉴别。本组1例呈Tg免疫阴性，提示Tg阴性，尤其是在甲状腺肿瘤穿刺活检标本中Tg阴性不能完全排除PTC的可能。在BTL组织中Tg表达可有不同，滤泡立方或柱状增生细胞免疫表达较滤泡腔内充满胶质而受压扁平或萎缩的滤泡细胞要强，如在结节性甲状腺肿组织中因胶质聚积，滤泡细胞受压明显，染色则较温和，相比而言，桥本氏甲状腺炎组织中增生的滤泡细胞着色较强，滤泡性腺瘤着色更强，但巨滤泡性腺瘤和伴乳头状增生性滤泡性腺瘤表达明显减弱以至部分区域呈阴性。TPO是甲状腺滤泡细胞合成的一种酶，生理状态下直接参与甲状腺激素的合成。研究显示TPO在BTL组织中均呈阳性，而在PTC组织中阳性表达率显著降低，提示TPO的表达对PTC和BTL具有鉴别意义。TTF-1是NKX基因家族中的同源转录因子之一，存在于内胚层分化的甲状腺滤泡细胞、间脑上皮和Ⅱ型肺泡上皮中。TTF-1在调节Tg和TPO的合成以及肺表面活性物质形成中发挥重要作用[2-3]。TTF-1常在甲状腺、肺上皮细胞及其肿瘤中表达，是器官特异性转录因子。因此，TTF-1是目前临床外检中用于确定转移癌原发部位的常用免疫标志物，染色阳性常被认为来源于甲状腺或肺。本研究结果显示TTF-1在PTC及BTL组织中阳性表达率均为100.0%，但在PTC组织中的染色强、弥漫且均匀。然而随着免疫组化的广泛应用，发现TTF-1还可表达于极少数结肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌，乳腺癌等肿瘤[4-5]。为克服TTF-1的局限性，临床实践中与Tg联合应用仍可在PTC与转移性癌鉴别诊断中起到重要作用。

3.2上皮细胞抗原或癌抗原标志物CK是上皮细胞的主要细胞骨架成分。本研究显示CK7、CK8/18在PTC和BTL组织中均呈高表达。CK19在PTC和BTL组织中表达差异明显，提示CK19有助于两者的鉴别。CK34βE12是一组包括CK1、CK5、CK10和CK14的中间丝蛋白。Liberman等[6]报道CK34βE12表达于91%的PTC，并将其解释为存在CK1的抗原决定簇，或是存在一种不能被CK5、CK10、CK14抗体所识别的抗原决定簇。Tan等[7]报道CK34βE12在PTC组织中呈强阳性表达。我们研究发现CK34βE12在PTC中阳性率为90.8%，与文献报道一致，着色模式呈斑驳状，在BTL组织中阴性或灶状弱阳性，表明CK34βE12有助于鉴别PTC和BTL。通过比较可以发现上述几种CK中以CK19、CK34βE12作为PTC与BTL鉴别诊断的参考指标较为理想。EMA广泛分布于各种正常上皮细胞及肿瘤中，亦可表达于PTC和BTL。CA19-9是一种消化道癌抗原，主要用于确定转移癌原发部位，染色阳性常被认为来源于消化道或胰腺。国外文献[8]曾报道CA19-9在PTC组织中的阳性表达率为70.0%，滤泡性腺瘤组织中无表达。我们研究发现CA19-9在PTC组织中阳性表达率为85.5%，在BTL组织中阴性或仅点灶状弱阳性着色。值得注意的是CA19-9不宜单独用于PTC，尤其是PTC颈部淋巴结转移灶[9]，而应与Tg、TTF-1联合检测以免误诊为消化道或胰腺癌转移。

3.3间皮细胞和细胞黏附素MC是间皮表面微绒毛的一种酸性氨基酸多聚糖蛋白，最初主要用于间皮源性肿瘤的诊断，近年来发现其在甲状腺良恶性疾病中具有鉴别诊断价值[10]。本研究显示MC在PTC组织中的表达显著高于BTL。值得注意的是，在PTC组织中MC阳性定位于细胞膜，顶端胞膜或腔缘着色增强，而在BTL组织中仅细胞质弱阳性，甚至可视为阴性，充分认识不同染色模式对疾病的鉴别诊断十分有利。MC对于PTC和BTL鉴别诊断具有重要价值。Galectin-3是一种同型细胞黏附凝集素，主要作用和同类细胞间黏附有关，亦有报道指出其与许多肿瘤的形成、细胞分化与凋亡、浸润和转移过程有关，如结肠癌、PTC等[10-12]。本研究发现galectin-3在PTC组织中的表达明显高于BTL，且细胞质和细胞核同时阳性，而在BTL组织中多为片状细胞质弱阳性，因此在PTC和BTL的鉴别诊断中有很好的提示意义。未发现其与包膜侵犯、淋巴结转移及肿瘤分期等有关。

3.4神经内分泌蛋白标志物CD56为神经细胞黏附分子，主要分布于大多数神经外胚层起源的组织及肿瘤中，临床上常与Syn、CgA联合用于神经内分泌肿瘤的诊断。EI Demellawy等[13]研究发现CD56在PTC组织中均呈阴性，而在癌旁甲状腺组织或BTL组织中呈阳性，特异性及敏感性为100.0%。我们发现PTC组织中CD56阳性表达率为7.8%，而在BTL组织中阳性表达率91.3%，研究表明CD56的失表达有助于PTC的鉴别诊断[12]。CD57为自然杀伤细胞因子，主要标记淋巴组织中的自然杀伤细胞，还与多种神经肿瘤发生反应，在神经内分泌肿瘤中应用较广。Khan等[14]研究了CD57在PTC组织中的表达，结果表明CD57表达于95%的PTC、10%的滤泡性腺瘤、27%的结节性甲状腺肿，并认为CD57对鉴别PTC和BTL是有帮助的。我们观察的结果与其较为相似，但需注意的是在BTL组织中滤泡内的胶质着色较强，甚至遮掩阴性的滤泡细胞。CD56和CD57组合从正反两方面对PTC进行鉴别诊断更具临床价值。

3.5细胞周期调节蛋白P27kip1是一种细胞周期调节有丝分裂因子和肿瘤抑制基因，作为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白，能抑制不同类型的Cyclin与细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin-dependent kinase，CDK)形成Cyclin-CDK复合物，阻碍细胞周期由G1期进入S期，对细胞周期起负调控作用。Cyclin D1是该家族的重要成员，为细胞周期的正调控因子，在生理状态下，细胞进入S期后Cyclin D1迅速分解。p27kip1失表达使其抑制细胞增长功能降低，则Cyclin D1持续高表达，导致G1期缩短，提前进入S期，细胞增殖失控，最终形成肿瘤[15]。我们观察到p27kip1在PTC组织中阳性表达率很低，在BTL组织中高；相反Cyclin D1在PTC组织中阳性表达率较高，而在BTL组织中阳性表达率较低。在PTC淋巴结转移和肿瘤分期Ⅲ～Ⅳ期患者中Cyclin D1的阳性表达率明显提高，p27kip1的阳性表达率进一步降低。研究[15-16]表明p27kip1丢失和Cyclin D1表达上调不但有助于PTC与BTL的鉴别诊断，而且与肿瘤预后有关。总之，联合检测p27kip1和Cyclin D1有助于PTC的鉴别诊断和预后判断。

综上所述，当遇见不典型病例或鉴别诊断有困难时，选择性联合检测上述指标，对PTC的确诊具有重要参考价值，有助提高正确诊断率。CK19、CK34βE12、MC、TPO、Galectin-3、CD56、CD57、CA19-9均可选作PTC和BTL鉴别诊断的首选抗体；p27kip1及Cyclin D1不但助于鉴别诊断，而且对预后判断有一定指导意义。Tg和TTF-1同时阳性对确定甲状腺滤泡上皮起源癌具有决定性意义。