结核性脑膜炎患者行脑脊液实验室检测方法的现状与进展

李雪莲 高孟秋

结核病是严重危害人类健康的全球性公共卫生问题。2016年，全球新发结核病患者约1040万例[1]。我国是世界结核病高负担国家，2016年登记患者总数为78万例[1]。Sunnetcioglu 等[2]报道，肺外结核约占全部结核病患者的49.4%，由于缺乏细菌学依据，肺外结核的诊断通常比肺结核更加困难。结核性脑膜炎(tuberculous meningitis，TBM)是最常见的肺外结核之一，约占全部结核病患者的1%，但却是导致结核病患者死亡最常见的一种类型，其病死率可达26.8%，而患者死亡多发生在最初的6个月[3]。因此，早期诊断及治疗是改善TBM预后的重要因素。目前TBM的诊断是通过对临床表现、脑脊液检测、头颅影像学检查及是否并发颅外结核等综合分析后作出的临床诊断[4]。但是，TBM的临床症状和体征，如头痛、发热、呕吐、意识障碍、瘫痪、脑膜刺激征等均缺乏特异性，很难与其他病原体引起的脑膜炎相鉴别，尤其在疾病初期，头颅影像学并不能呈现出特异性的改变，很容易误诊，老年TBM的误诊率更是高达59.1%[5]。因而，TBM的诊断已成为临床亟需解决的重要课题。

脑脊液实验室检测对诊断TBM具有重要意义，通过检测脑脊液中的结核分枝杆菌及其特异性的标志物，将为TBM的诊断提供重要帮助。笔者就TBM患者行脑脊液实验室检测方法的现状与进展进行综述。

病原学检测方法

一、细菌学检测方法

脑脊液涂片找到结核分枝杆菌是诊断TBM的直接证据，应用萋-尼(Ziehl-Neelsen)染色法染色后显微镜检查是目前临床上最常用的方法，成本较低，操作简便，但阳性检出率相对较低，国外报道阳性率为7.9%[6]，国内仅为4.84%[7]。何红彦等[8]采用玻片离心改良抗酸染色检测法，检出率由常规方法的11.7%提高至61.7%。邹月丽等[9]报道的阳性率达94.29%。Chen等[10]应用这一方法对48份脑脊液标本(BACTEC MGIT 960培养系统培养阳性)进行检测，发现其阳性检出率高达100%。而Zou等[11]发现，通过品红染色抗酸杆菌，其在荧光显微镜下的敏感度为96.2%，而阳性率为79.2%。上述方法较好地提高了脑脊液涂片查找抗酸杆菌的敏感度，但均需进行多中心大样本的临床研究以确认其诊断价值。

脑脊液培养是目前诊断TBM特异度最高的方法，常规方法为罗氏(Löwenstein-Jensen)培养法，但由于结核分枝杆菌生长缓慢，大约需31～42 d[12-13]，无法为临床诊断提供及时的帮助。应用BACTEC MGIT 960系统(美国BD公司)、BACTEC TB 460系统(美国BD公司)、MB/BacT系统(荷兰奥根泰尼克公司)和ESP系统 Ⅱ(美国BD DifcoTM公司)等方法可以将获得结果的时间缩短至2～8周，但敏感度仍然很低(16%～51%)[14-16]，无法满足临床需求。

二、分子生物学检测

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是检测结核分枝杆菌DNA的一种常用技术。PCR技术检测的敏感度及特异度均高于常规的细菌涂片和培养方法[17]。在脑脊液标本上使用核酸扩增试验(nucleic acid amplification tests，NAATs)检测在20年前就有报道[18]，并且由此产生了多种PCR检测方法。然而，由于这些方法的设计和表现不同，使得各种不同方法之间的比较存在困难。2003年，Pai等[19]就不同PCR方法对TBM的诊断准确性进行了Meta分析，发现商业化PCR检测在脑脊液样品中的敏感度为56%，特异度为98%。之后又出现多种应用不同靶标[插入序列6110(IS6110)、蛋白质抗原B(protein antigen B)、rpoB基因片段、MPB64基因片段]和测试平台的PCR检测方法，总体性能得到了改进。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种新的DNA扩增技术，通过设计两条环形引物，可以加速反应，提升敏感度。Modi等[20]的研究显示，在确诊的TBM患者中，LAMP的敏感度为96%，特异度为100%，在所有TBM患者(包括确诊和疑似患者)中，LAMP的敏感度高于PCR。Nagdev等[21]发现LAMP技术诊断TBM的敏感度为88.23%，特异度为80%，优于巢式PCR检测。孙雯雯和肖和平[22]也报道，应用基于IS6110基因片段的LAMP技术诊断TBM的敏感度为43.02%(74/172)，明显高于脑脊液抗酸染色和培养，与实时荧光定量PCR相似。上述国内研究结果中LAMP法诊断TBM的敏感度(43.02%)明显低于国外同类研究，可能与我国在检测技术条件上和发达国家存在较大差异有关；另外，LAMP技术应用于脑脊液检测的研究较少，操作人员经验欠缺，可能存在一定的误差，这也是导致研究结果差距的可能原因。但仍然可以看到，脑脊液LAMP检测是诊断TBM的一种快速、敏感、特异的方法，优于PCR检测，而且操作简便，没有分子生物学基础的检验人员经过培训也能掌握该项技术，适用于在基层地区开展。

线性探针技术(line-probe assays，LPAs)是近年来兴起的一种检测技术，通过PCR技术将结核分枝杆菌的基因组特定片段进行扩增，并将扩增的产物与固定在尼龙膜上的寡核苷酸探针杂交，通过酶联免疫法显示结果。2017年Kaviyil和Ravikumar[17]报道的一项对10 281 例脑脊液标本的检测结果显示，LPAs的敏感度为96.15%，特异度为100.00%，在培养阳性患者中的检出率高达97.67%。同时，LPAs对诊断异烟肼和利福平耐药结核分枝杆菌也具有很好的敏感度和特异度。张国钦等[23]发现，以全自动BACTEC MGIT 960检测法为金标准，GenoType MTBDRplus分子线性探针法对异烟肼耐药性检出的敏感度和特异度分别为68.7%和98.9%，对利福平耐药性检出的敏感度和特异度分别为92.6%和97.5%。LPAs技术可以极大地缩短耐药结核病的检出时间，在耐药基因检测及结核分枝杆菌菌种鉴定方面具有重要的作用。

Xpert MTB/RIF是在美国赛沛公司“GeneXpert”PCR平台基础上开发的一种新型、全自动实时荧光定量检测技术，包括“GeneXpert”PCR平台和Xpert MTB/RIF诊断试剂盒。其被WHO推荐用于肺结核及肺外结核的诊断，优势在于其操作简单，只需要很少的专业技术知识和生物安全要求，并且交叉污染的概率很低[24]，2 h即可获得结果。近年来，有众多关于Xpert MTB/RIF诊断肺结核准确性的报道。由创新诊断新技术基金会(Foundation of Innovative New Diagnostics，FIND)组织的一项包括南非、秘鲁、阿塞拜疆和印度的多国评估结果显示，在纳入的1730 例肺结核患者中，Xpert MTB/RIF在涂阳患者中的检出率为98.2%(551/561)，在涂阴患者中为72.5%(124/171)[25]。Chang等[26]的Meta分析结果显示，在18项研究的10 224份样本中，Xpert MTB/RIF诊断肺结核的敏感度为90.4%，特异度为98.4%。这些研究结果促成了WHO对该方法的认可与推荐[27]。而Xpert MTB/RIF由于对脑脊液标本的研究较少，样本量小，结果各异。Patel等[28]在结核病高负担国家之一的南非进行的研究发现，Xpert MTB/RIF诊断TBM的敏感度为62%，特异度为95%。Rufai等[29]的研究却发现Xpert MTB/RIF在脑脊液标本中的检测阳性率仅为14.2%，低于BACTEC MGIT 960培养系统(19.5%)。杨元利等[30]的研究发现，Xpert MTB/RIF检测脑脊液标本的敏感度为23%(14/61)。如果在进入系统前将脑脊液标本进行离心，可以将诊断的敏感度提升至72%[31]。Xpert MTB/RIF Ultra是基于GeneXpert平台的一种全新的、全自动巢式实时PCR检测技术，其在HIV阳性的TBM患者中的敏感度为70%，而将样本量增加到6 ml以上，阳性率可由7%提高到26%[32]。虽然WHO推荐将脑脊液Xpert MTB/RIF检测作为初步诊断TBM的方法，但Boyles和Thwaites[33]提出，有效的TBM诊断试验的阴性预计值应达到99%，而Xpert MTB/RIF检测只有84%左右，因此应首先强调Xpert MTB/RIF对于TBM诊断的有限性；另外，需要强调Xpert MTB/RIF检测需要大量的脑脊液(理想情况下为8～10 ml)。因此，WHO在制定指南时应对TBM的诊治路径有明确的指导，并不会因Xpert MTB/RIF检测而影响路径的实施。

免疫学检测方法

腺苷脱氨酶(adenosine deaminase，ADA)是一种核苷酸氨基水解酶，广泛分布于人体各组织中。ADA检测快速、简便，在结核性胸膜炎、结核性腹膜炎、结核性心包炎等的诊断中均广泛应用。TBM患者脑脊液ADA升高可能是由于T淋巴细胞对病变局部刺激产生的一种反应。大量的研究表明，脑脊液中ADA的测定有利于鉴别TBM和其他神经系统疾病[34-36]，Pormohammad等[37]的Meta分析结果也显示脑脊液ADA对TBM诊断的准确性相对较高，敏感度和特异度分别为89%和91%，但其临界值(cut-off值)相差较大(在6～15.5 U/L之间)。目前，国内外对TBM脑脊液中ADA的cut-off值尚没有统一的界定。而且脑脊液中ADA活性升高并非仅见于TBM，凡能引起中枢神经系统免疫功能变化的疾病都可导致ADA活性改变。Corral等[38]的研究显示，在神经系统巨细胞病毒感染、隐球菌感染、淋巴瘤、念珠菌性脑膜炎的患者中发现ADA升高。一项系统综述也显示[39]，在纳入的13项研究中(338例TBM患者)，不能确定合适的cut-off值来鉴别TBM和细菌性脑膜炎。因此，只有当除外细菌性脑膜炎后，脑脊液ADA对TBM的诊断才具有重要价值。

γ干扰素(interferon-γ，INF-γ)是结核分枝杆菌免疫反应的主要介导者，它参与巨噬细胞激活和辅助性T细胞(Th)1 淋巴细胞的转化过程。近年来，大量的研究报道应用γ干扰素释放试验(interferon-γ release assay，IGRA)诊断活动性和潜伏性结核感染[40-42]。虽然IGRA对肺结核诊断的价值有限[43]，但是将IGRA应用于浆膜腔积液的检测可能更有价值[44]。一些研究显示脑脊液IGRA检测具有较好的特异度，但敏感度欠佳(58%～68%)[45-47]。IGRA同样存在着一些缺陷：约10%～80%的检测出现不确定的结果；需要大量的脑脊液标本(5～10 ml)才能获得足够数量的细胞等。而且IGRA与罗氏培养之间的一致性较差，出现这种情况可能是因为脑脊液中的IFN-γ也是免疫反应的一部分，可能有助于清除脑脊液中的细菌，导致阴性的培养结果。因此，这些非培养方法似乎不能作为确诊试验，而只能作为补充试验[48]。

其他检测指标

近年来，一些新的脑脊液检测指标应用于TBM的诊断，显示出了一定的价值，但均需更进一步的研究来确定。

一、花生四烯酸盐5脂氧合酶(arachidonate 5-lipoxygenase，ALOX-5)

ALOX-5是白三烯B4和脂氧素代谢途径中的一种酶，已被证明在小鼠结核病的发病机制中起作用[49-50]。Kataria等[51]通过对TBM患者脑脊液标本进行蛋白质组学分析，发现11种人蛋白和8种分枝杆菌蛋白表达水平改变，其中ALOX-5通过蛋白质印迹技术得到了验证。该研究证实了ALOX-5作为疾病发病机制中新的诊断标记和关键分子的潜在价值。

二、乳酸

乳酸是人体中一种常见的代谢物，以两种立体异构体——(对映异构体)-L-乳酸和D-乳酸的形式存在。在人体中，L-乳酸被认为是乳酸正常的生理存在形式。D-乳酸水平升高通常是由于肠道创伤或胃肠道疾病。Hill等[52]检测了467个脑脊液标本中的乳酸水平，发现最低阈值为3 mmol/L时，敏感度为81.8%，特异度仅为56.6%；而阈值为6 mmol/L时，特异度最高，达到94.2%，但敏感度仅为54.6%。因此没有合适的乳酸阈值作为诊断TBM的标准。Mason等[53]则首次报道了TBM患者的脑脊液中观察到的乳酸为L-乳酸，但这可能仅仅是宿主对感染的反应。小胶质细胞可以优先利用乳酸作为能量底物，因此，TBM患者中乳酸水平的升高似乎是因为它是一种重要的能量底物并且具有保护神经的能力，并没有任何细菌的作用。

三、阿拉伯糖甘露糖脂(lipoarabinomannan，LAM)及其IgG抗体

LAM是分枝杆菌菌属所特有的菌壁成分，具有菌属特异性，故可以应用LAM及其抗体作为结核病诊断与鉴别诊断的指标。Shah等[54]的研究发现，尿LAM侧流法(lateral flow assay，LFA)检测可用于诊断HIV阳性成年人的活动性结核病。Cox等[55]检测了91例患者的脑脊液发现，对于组织病理学诊断确诊的TBM，LAM-LFA的敏感度为75%，特异度为87%。对于组织病理学不典型而存在其他部位结核病的TBM，LAM-LFA的敏感度为50%，特异度为70%，对于应用综合诊断标准诊断的TBM患者，LAM-LFA的敏感度为68%，特异度为78%。Patel等[56]的研究显示，在HIV感染率较高的地区，LAM检测方法在脑脊液标本中的敏感度为31%，特异度为94%。因此，脑脊液中的LAM可作为TBM的辅助诊断工具。

四、热休克蛋白(heat shock protein，Hsp)

Hsp是一组在结构上高度保守的多肽，广泛存在于自然界原核、真核细胞中，不同相对分子质量的Hsp(Hsp90、Hsp70、Hsp65和Hsp10等)在细胞内的分布不同，广泛存在于结核分枝杆菌中，Hsp90、Hsp70、Hsp65和Hsp10等多种家族成员在结核感染期间可在宿主中引起强烈的免疫反应。关于Hsp在TBM患者中的诊断意义的报道较少。Mudaliar 等[57]应用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测脑脊液中相对分子质量为65 000(65 kD)的Hsp的水平，发现其明显高于非TBM患者和非感染性神经系统疾病患者。Shekhawat等[58]发现Hsp70和Hsp90对TBM诊断的敏感度分别为89%和88%，特异度分别为82%和89%，具有潜在的诊断价值。

综上所述，近年来临床虽然对TBM的理解和认识有所进步，但TBM仍是结核病最致命的类型之一，提高生存率的最好方法是快速准确地诊断和迅速开始治疗。目前，诊断TBM的实验室检测方法并不能完全满足临床需求，且很多文献报道的检测方法敏感度超出我国的临床实际情况，这可能与脑脊液标本量、收集方法、早期应用广谱抗生素[59-60]等因素有关。但最近的一些发展已经显示出了希望，包括提高涂片显微镜镜检敏感度的方法、自动化核酸扩增平台的开发及使用新的生物标志物等，但都需要进行更多及更大范围的研究来确定。

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