Klotho蛋白在慢性肾脏病中作用的研究进展

陈 静， 章晓燕， 丁小强

复旦大学附属中山医院肾内科，上海 200032

早在1997年人们就发现了Klotho基因[1]，其主要表达于肾脏，编码蛋白为单链跨膜蛋白，在胞膜上与FGF23受体形成复合体，进而发挥生物学作用[2-3]。Klotho蛋白缺乏可导致肾脏纤维化、心肌肥厚、血管钙化等[4]。本课题组前期研究发现，Klotho的表观遗传学改变(主要是DNA甲基化)参与慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)相关血管钙化的发生，说明其在CKD发生发展中发挥一定作用。本文对Klotho及其在CKD中作用的研究进展作一综述。

1 Klotho家族

Klotho家族包括α-Klotho、β-Klotho和γ-Klotho。成纤维生长因子(FGF)与单独的FGF受体(FGFRs)或Klothos亲和力较低，而与FGFRs-Klotho复合体亲和力较高[5-7]。大部分组织和细胞表达FGFRs，而Klotho的表达有组织特异性。其中，α-Klotho主要在肾脏和甲状旁腺内表达，与FGFR1c、FGFR3c、FGFR4结合后成为FGF23的高亲和力受体；β-Klotho主要在肝脏和脂肪组织表达，与FGFR1c、FGFR4结合后分别成为FGF15/19、FGF21的高亲和力受体；γ-Klotho主要在眼、脂肪和肾脏表达，与FGFR1b、FGFR1c、FGFR2c结合后成为FGFR4/FGF19高亲和力受体[8]。

α-Klotho和β-Klotho基因编码Ⅰ型单链跨膜蛋白，且编码蛋白有41%的氨基酸相同。α-Klotho和β-Klotho蛋白的胞外部分为含有由2个串联重复序列组成的β-葡萄糖苷酶样结构，胞内部分则很短且无生物功能[9]。γ-Klotho基因编码的单次跨膜蛋白较短，含有1个β-葡萄糖苷酶样结构。β-Klotho作为受体的一部分与FGF15/19或FGF21结合后参与能量代谢调节，作用同α-Klotho-FGF23复合物。FGF15/19在小肠中的表达受胆汁酸调节[10]。进食后，胆汁酸释放入小肠，与肠黏膜法尼醇Ⅹ受体结合，从而激活FGF15/19基因的表达。在小肠合成的FGF15/19作用于肝脏，使肝脏内β-Klotho和FGFR4表达增加，同时抑制胆汁酸合成限速酶胆固醇7α-羟化酶(CYP7A1)基因的表达，进而抑制胆汁酸合成。小鼠由于缺乏β-Klotho和FGFR4(或FGF15)，导致CYP7A1基因过表达，胆汁酸合成增加。由于Klotho蛋白的胞内段非常短，不能传导任何信号，因此推断Klotho胞外段对FGFRs受体作用的发挥只起了辅助作用。而且，选择性的剪切Klotho基因外显子3，可以导致长度较短的Klotho蛋白从细胞中释放，并以可溶性胞外蛋白的形式存在[11]。

2 Klotho的生理作用

Klotho蛋白有膜结合型和分泌型两种形式。在小鼠、大鼠以及人的肾脏，膜结合型Klotho主要表达在远端小管和近端小管，在内髓收集管也有少量表达。分泌型Klotho蛋白是Klotho基因选择性剪切表达后直接释放到胞外，广泛存在于体液中。分泌型Klotho蛋白可由膜结合型Klotho胞外段被去整合素金属蛋白酶10(a desintegrin and metalloproteinase 10，ADAM10)和ADAM17剪切后形成，这一生理过程受胰岛素和金属蛋白酶抑制剂的调控。膜结合型Klotho和分泌型Klotho蛋白有不同的生物学作用。膜结合型Klotho与FGFR结合后发挥FGF23受体的作用。分泌型Klotho的作用更像内分泌因子，在调节离子通道、Wnt信号通路，拮抗肾素-血管紧张素Ⅱ-醛固酮系统，抗衰老和抗氧化方面发挥重要作用。此外，Klotho还可以通过抑制肾脏1α-羟化酶表达来调节钙代谢，与FGF23结合后调节甲状旁腺激素(PTH)的合成。

分泌型Klotho存在于血液、尿液和脑脊液[12]，独立发挥体液因子的作用[13]。α-Klotho胞外段由被锚定在细胞膜上的蛋白酶ADAM10或ADAM17剪切。目前，仅在血液、脑脊液和尿液中发现α-Klotho脱落的胞外段[14-15]，而未发现分泌型β-Klotho和γ-Klotho。血浆中α-Klotho的浓度为10～50 nmol/L，尿中的浓度较血浆中高，脑脊液中的浓度不确定[15]。然而，Klotho胞外段脱落的上游调控机制如何，调节循环Klotho水平的传入机制如何，以及分泌型Klotho的生物学作用有哪些等问题还有待解决。此外，关于分泌型Klotho是否可以作为FGF23的共同受体发挥生物学作用，目前还存在较大争议。

分泌型Klotho有潜在的类似于唾液酸酶的作用[16]。唾液酸酶可以除去细胞表面的N连接糖链的几种糖蛋白。分泌型Klotho通过对细胞表面瞬时受体电位阳离子通道5(transient receptor potential cation channel，subfamily V, member 5，TRPV5)和肾外髓钾通道1( renal outer medullary potassium channel 1，ROMK1)蛋白N末端糖链的修饰，防止这些蛋白的内吞，从而增加了钙和钾的内流。而对于钠-磷协同转运体2a(sodium-phosphate cotransporter 2a, NPT2a)，分泌型Klotho则通过对其糖链的修饰起到促进内吞和灭活的作用。

此外，分泌型Klotho还可以抑制胰岛素、胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)、Wnt信号通路[17]和转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)[18]的活性。对健康动物注射分泌型Klotho可产生调节体内代谢的生物学效应，这支持分泌型Klotho可延缓衰老的调节功能。尽管目前认为分泌型Klotho可结合FGFs或自身的二聚体跨膜Klotho，但其受体及结合FGFs可以介导何种信号传导还不能确定。分泌型Klotho有糖链修饰酶的作用[19]，但其信号传导受体被确认之前，还不能被认为是一种内分泌激素。

3 Klotho与CKD

CKD是一个全球性的公共健康问题，不同国家的发病率为5%～10%[19]。Klotho基因敲除鼠的表型与CKD患者的临床表现相似，包括软组织异位钙化、高磷血症和高血浆FGF23，提示CKD患者可能缺乏Klotho。Klotho蛋白缺乏可以出现肾脏纤维化、心肌肥厚、血管钙化等慢性肾脏病病理表现[19]。本课题组前期研究[20]发现，Klotho的表观遗传学改变(主要是DNA甲基化)参与CKD相关血管钙化的发生。

虽然临床上CKD患者肾脏Klotho mRNA和蛋白的表达水平检测受限，但已有研究证实CKD患者肾组织Klotho表达水平降低。近年来出现了一种新的ELISA方法，可用于检测CKD患者的血浆Klotho水平[21]。研究[22]显示，血浆Klotho水平与血肌酐、尿素氮及FGF23相关，表明血浆Klotho水平可能受到肾功能的影响；但CKD患者尿中Klotho水平在CKD早期即下降，并且随着CKD进展而进行性下降；在CKD动物模型中，Klotho水平的变化在血浆、尿液和肾脏是一致的，但在人体内这一相关性还有待进一步证实。大多数CKD模型中，包括肾切除模型、肾炎模型、肾中毒模型、糖尿病肾病模型以及高血压肾损伤模型，都显示肾脏Klotho mRNA及蛋白的表达水平与血浆、尿液中可溶性Klotho水平一致[22]。

4 展 望

CKD的防治是一个亟待解决的公共卫生难题。CKD可进一步进展为需要进行维持性透析或肾移植的终末期肾病(end-stage renal disease, ESRD)。要预防和治疗CKD，需要对肾脏病的发生发展机制进行研究，寻找可行的检测、治疗靶标，进而进行精准靶向、个体化治疗，改善患者的预后。Klotho作为目前较为肯定的肾脏保护蛋白，有待对其在CKD发生发展中的作用及机制进行深入研究。

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