骨癌痛模型研究进展*

张春鹏 周庆辉

（1上海中医药大学，上海 201203；2海军军医大学附属长海医院中医系，上海200433）

癌症引起的骨痛(cancer induced bone pain,CIBP)是恶性肿瘤晚期骨转移引起的一种严重的并发症。据报道CIBP病人在疾病后期一直经历着中度到重度的疼痛[1]，严重破坏病人的生活质量和影响病人的生存状况。CIBP是一种独特而复杂的慢性疼痛并且机制不明确[2]，特点有机械触诱发痛和痛觉过敏[3]。目前尚无确切有效的药物治疗，只能通过对症治疗来缓解病人的症状，提高病人的生活质量。建立可靠的骨癌痛动物模型，将有利于研究CIBP的基本作用机制，对开发治疗CIBP的药物和方法，弥补临床经验的不足和局限是至关重要的。骨癌痛模型的建立也经过了漫长的探索与不断地革新，本文主要从骨癌痛模型建立的发展过程进行综述，希望为骨癌痛的研究提供造模参考。

一、骨癌痛模型建立的研究过程

骨癌痛模型的建立经过了漫长的探索过程。1994年，Kjønniksen等[4]在裸大鼠胫骨直接穿刺并注入肿瘤细胞，才成功地制作了肿瘤骨转移模型。1999年，Schwei等[5]首次报道了小鼠骨癌痛模型。2002年，Medhurst等[6]将同源的MRMT-1大鼠乳腺癌细胞接种到SD大鼠胫骨上段骨髓腔内，成功地建立了骨癌痛大鼠模型。自此，骨癌痛模型建立的方法日渐成熟，并且逐渐完善。

1.小鼠骨癌痛模型

小鼠作为一种重要的实验工具，在动物实验中占据非常重要的地位。Schwei等[5]切开麻醉后的小鼠左腿胫骨膝关节，然后用19号规格的注射器将20 ml含有1×105个NCTC 2472纤维肉瘤细胞的培养液注射到B6C3和C3H/HeJ小鼠股骨远端的骨髓腔内并密封注射点，诱发骨肉瘤生长使骨质破坏，从而建立了原发性骨癌痛模型并且观察了模型病理破坏情况：在第21天，注射到骨骼周围肌肉的肿瘤因为有结缔组织的包裹而并未发生骨质破坏，注射到骨髓腔的肿瘤细胞的增长使得骨质破坏严重，甚至肿瘤穿透骨骼长到骨外。并且，他发现模型小鼠与正常小鼠比较，脊髓部分有三种非常大的变化。一是在脊髓L3-L5之间有一种强啡肽的表达，在L4表达最明显。二是在脊髓L3-L5之间c-Fos蛋白的表达比正常鼠上升，并且c-Fos的表达与骨破坏的程度呈正相关。三是骨癌痛鼠手术同侧的脊髓中出现巨大的星形胶质细胞的增多，并且与骨破坏呈正相关。Schwei的做法是一种比较成熟的造模方式，采用固定浓度的肿瘤细胞注射到固定部位，产生的模型稳定性好，并且可重复。

对造模的肿瘤细胞的选择是影响造模是否成功的一个重要因素。Wacnik等[7]采用C3H/He小鼠，用0.3 ml无菌胰岛素注射器钻穿跟骨，将2×105个NCTC2472 纤维肉瘤肿瘤细胞或者1.5×105个B16-G3.26 黑色素瘤细胞注射到跟骨内，制造小鼠跟骨骨癌痛模型，对比两种肿瘤细胞对在造模方面的影响，并对小鼠进行机械痛觉过敏测试和冷痛觉过敏测试。结果发现虽然黑色素瘤细胞使骨和骨膜分离，使骨的边缘不齐，但是并未对骨骼造成实质性的破坏；黑色素瘤小鼠并未出现疼痛的现象，也未观察到小鼠有疼痛的行为表现。而纤维肉瘤的肿瘤细胞增殖产生了明显的骨质破坏，动物在行为上有明显的曲爪和跛足等疼痛表现；机械痛觉过敏测试在第3天出现明显的升高，在6～15天明显的高于假手术组和正常组；在7～16天的冷痛觉测试中，模型小鼠在2～4℃的冷板上的疼痛反应行为明显多于假手术组和正常组。从Wacnik的研究结果来看，黑色素瘤在骨癌痛模型的造模中作用并不理想，为后来的实验排除了肿瘤细胞选择的障碍。Cain等[8]使用 C3H/He 小鼠，将 NCTC 2472纤维肉瘤肿瘤细胞，用规格为0.3 ml的无菌胰岛素注射器的一次性针头手工钻穿跟骨并注射到里面。结果发现纤维瘤细胞的增长导致骨破坏；在第7天和第10天机械痛觉过敏高于假手术组；该模型在第13天出现冷痛觉过敏，在2～3℃的冷板上痛觉过敏行为多于假手术组。在这两项研究中，研究者对模型进行机械痛痛敏和冷痛觉过敏的评价。疼痛评价是考察骨癌痛模型建模是否成功的重要指标，对描述模型有重要意义。

早年研究者大多用小鼠来造模的主要原因是因为肿瘤细胞的细胞系多来源于小鼠，但是小鼠体重小，肿瘤细胞数量不易掌握。并且在实施操作方面，由于小鼠的跟骨体积较小，造模过程中不方便，模型生长过程不适宜观察，所以在小鼠骨癌痛模型的探索中出现了小鼠的胫骨骨癌痛模型。Menéndez等[9]使用C3H/He小鼠，用25号规格的针头钻入胫骨平台，然后用规格为30号的汉密尔顿注射器将1×105水平的NCTC 2472纤维肉瘤细胞注射到胫骨内制造骨癌痛模型。Menéndez等人在评价该模型的痛觉时使用自发痛活动和热板(55±1℃)，模型组自发痛觉活动在第1周内就发生了改变，并且在随后自发痛觉活动评分随着时间增加，在第三周评分增长达到顶峰，随后增长趋缓。热板测痛方面，在第一周模型组小鼠的手术侧和非手术侧就开始出现痛觉减退；在第2周非手术侧回归正常，手术侧仍旧痛觉减退；在第3周小鼠手术侧的这种痛觉减退现象消失了，小鼠的热感觉回到假手术组水平，模型组在前3周与假手术组痛觉减退时间无明显的统计学差异；在第4周和第5周，模型组小鼠手术侧出现显著的热痛觉过敏反应，并且与假手术组比较有明显的差异。Menéndez等人发现，在第2周注射纳洛酮的小鼠没有出现热痛觉减退现象，而在第4周注射吗啡又可以逆转模型小鼠双侧的热痛觉过敏现象。在整个模型中小鼠自发痛现象在接种后第三周达到顶峰，热板测试则表现出先痛觉减退后痛觉过敏的现象，并且痛觉减退可以被纳洛酮控制，痛觉过敏可以被吗啡逆转，于是研究者认为这个模型出现热刺激过敏现象的时间较晚，在出现热痛觉过敏之前出现了一种阿片受体介导的痛觉减退。

King等[10]使用C3H/He小鼠，首先将膝关节关节切开，然后用X光拍照帮助下，将CCL-11肿瘤细胞（一种NCTC 2472纤维肉瘤细胞的克隆细胞）注射到股骨远端的骨髓腔里，最后用汞合金密封伤口，建立小鼠股骨骨癌痛模型。King等使用热板(52℃)、自发痛、运动诱发痛和机械痛阈评价此模型，并使用吗啡进行治疗观察效果。模型组热板测试直到第12天仍未出现明显的热痛觉过敏；模型在第12天出现自发性疼痛，使用吗啡并没有引起假手术组小鼠的自发痛，却增加了癌痛组自发性疼痛；模型组运动诱发疼与假手术组相比在第12天出现差异，并且在使用吗啡后的模型小鼠在第10天就出现了与假手术组有差异的疼痛行为，吗啡提前了运动诱发痛的产生；模型组在第6天出现轻微的机械痛阈下降，但是与假手术组没有显著差异，第10天和第12天出现明显的机械痛阈下降，与假手术组比较有明显的差异，并且在第10天和第12天，此癌痛模型在使用吗啡后与未使用吗啡的癌痛小鼠相比机械痛阈下降，两者比较有统计学差异。于是King等得出结论，吗啡给药过程中并非吗啡剂量越大，给药时间越长越有效。并且他们在实验过程中观察到吗啡使用剂量的加大，促使骨癌痛小鼠肿瘤患肢的骨痛、骨质疏松和自发骨折加速发生。该研究虽然并未能对骨质疏松和骨折进行量化，但该实验为临床治疗骨癌痛中吗啡的使用提供了新的指导思路。Seong等（Seong等，2005）和Lee等（Lee等，2005）使用肝癌细胞在C3H/HeJ小鼠身上制作骨癌痛模型，黄东等（黄东等，2008）使用Lewis肺癌细胞在C57BL/6小鼠股骨内建立肺癌细胞的骨转移癌痛动物模型，从而开始了小鼠转移型骨癌痛模型的探索。从最开始的纤维肉瘤细胞建立骨癌痛模型，由于骨组织周围肌肉丰富是纤维肉瘤的多发部位，随着时间的增长，可能会出现伴发的肿瘤从而影响实验，这可能是骨癌痛模型从原发性骨癌痛模型向转移型骨癌痛模型发展的原因。

2.大鼠骨癌痛模型

在小鼠骨癌痛模型发展的过程中，大鼠骨癌痛模型也得到了长足的进步。与小鼠模型相比，大鼠由于体重的原因，在肿瘤细胞数量上可控范围变大。同时大鼠骨骼较小鼠粗，造模实施过程中方便操作。在肿瘤的选择上大鼠最早开始的是肿瘤转移性模型。Medhurst等[6]用23号的针头刺穿雌性SD大鼠胫骨膝关节处的骨骺平台，深入胫骨5 mm处，然后将同源的3×103和3×104水平的MRMT-1大鼠乳腺癌细胞接种到胫骨上段骨髓腔内，MRMT-1细胞产生了迅速扩张的胫骨肿瘤，使胫骨边缘造成严重的破坏和骨重塑，建立了一种大鼠胫骨转移型骨癌痛模型。对模型进行机械诱发痛和机械痛觉过敏测试，3×103骨癌痛组的大鼠在第14天出现明显的机械诱发痛，直到第19天机械诱发痛不断增加，整个实验中未观察到对侧出现机械诱发痛，而3×104组的大鼠因为生命状况的原因在第16天终止了实验；3×104组的大鼠在第13天开始机械痛阈显著低于注射汉克平衡盐的对照组，而3×103组大鼠直到第20天才出现痛阈低于注射汉克平衡盐溶液的对照组。研究者对胫骨进行骨矿物质密度(bone mineral density, BMD)和骨矿物质含量(bone mineral content, BMC)检测，发现模型组有严重的骨重塑甚至被肿瘤侵蚀为针状的外观。在机制方面，研究者发现骨癌痛不同于持续的炎症疼痛或者神经病理性疼痛，其疼痛发生时P物质受体发生了变化，并且在脊髓浅层的c-Fos神经细胞的表达发生了明显的变化。脊髓神经化学的改变和对原发性传入的敏感程度的改变与骨破坏程度和肿瘤生长的程度呈正相关。

有研究证实大鼠在性激素引起的疼痛方面比小鼠表现更明显（Craft等，2004），为肿瘤细胞的选择上做出导向。Zhang等[11]用前列腺癌细胞构建大鼠的骨癌痛模型。研究者将大鼠的胫骨用23号针头钻孔，然后将AT-3.1前列腺癌细胞系的肿瘤细胞（3×105个细胞）用注入雄性哥本哈根大鼠胫骨骨髓腔内，用骨蜡封孔。评价此模型的热痛觉过敏、机械痛觉过敏、机械诱发痛。结果，骨癌痛大鼠造模一侧在第15天和19天与假手术组相比出现明显的热痛觉过敏；在第13天和第20天骨癌痛组造模侧与假手术组比较出现明显的机械痛觉过敏，骨癌痛组非造模一侧并未出现痛阈下降；在第16天和第20天，模型大鼠造模侧机械诱发痛反应时间明显缩短，与非造模侧有明显的差异。并且Zhang等人还在研究中发现10 mg/Kg的吗啡比5 mg/Kg的吗啡更明显的减少了此模型大鼠的自发缩足反应时间。Ciantis等[12]采用MLL前列腺癌细胞（1×107水平）重复此模型也可成功。

70%的晚期乳腺癌或前列腺癌病人都有骨骼转移，90%死于乳腺癌或前列腺癌的病人都存在骨转移[13]。乳腺癌骨转移对骨癌痛的研究是非常重要的一方面。在现有的骨癌痛的模型研究中，乳腺癌细胞建立的骨癌痛模型作为现今最常用的大鼠骨癌痛模型，从肿瘤细胞的类型到肿瘤细胞的浓度都经过了多年的探索和研究。Mao-Ying等[14]将4×105和4×103水平的Walker 256乳腺癌肉瘤细胞注入雌性Wistar大鼠胫骨骨髓腔内，建立Walker 256乳腺癌的骨癌痛模型，并且评价模型的自发性疼痛、热痛觉过敏和机械痛敏。该模型4×105组的动物在第7天出现跛足等自发痛现象，4×103组的动物在第10天也出现跛足，但是注射肿瘤细胞多的大鼠跛足行为更严重；两水平的骨癌痛模型对热痛觉没有明显的疼痛表现；注射4×105水平肿瘤细胞的癌痛模型在第4天出现明显的机械痛觉过敏，而4×103组的大鼠在第6天才出现，并且他们在此模型中还观察到癌痛大鼠非造模侧也出现机械痛阈下降的现象，此癌痛模型出现镜像痛现象。严继贵等（严继贵等，2007）重复此造模，发现随浓度增加，模型的肿瘤增长不断加剧，但是并未提及模型成功最小剂量和大鼠的致死剂量等。Lan等[15]将Walker 256乳腺癌肉瘤细胞注入雌性SD大鼠胫骨骨髓腔内建立了SD大鼠的胫骨癌痛动物模型。Doré-Savard等[16]对乳腺癌的骨癌痛模型在细胞和注射部位进行了改进，他们选择大鼠MRMT-1乳腺癌细胞，注射部位选择股骨内上髁和收肌结节之间。李华艳等（李华艳等，2011）使用MADB-106乳腺癌细胞重复此模型，并取得成功。张中军等（张中军等，2013）发现雄性SD大鼠也可用于制作Walker 256乳腺癌细胞诱发的骨癌痛模型。

二、讨论

癌症引起的骨痛是癌症病人中晚期遭受的常见的并发症之一，有文献显示癌症病人在遭受疼痛的同时还遭受严重的抑郁和焦虑的情绪[17]。骨癌痛模型的建立为探究其机制提供了非常好的基础。骨癌痛由于疼痛难以忍受，所以在机制方面研究者大多以其疼痛的形成为研究方向，希望得到有效的方法可以控制这种疼痛。在骨癌痛模型中免疫系统和神经系统互相作用，癌细胞产生的PD-L1作用于T细胞上的PD-1受体，掩饰癌细胞逃脱免疫机制[18]。在中枢系统中，下行易化通路和cAMP-PKA通路中多种神经递质和炎性成分参与骨癌痛的形成[19,20]。骨癌痛模型的制作时骨癌痛机制研究的基础。

在研究骨癌痛的实验研究历程中，研究者首先考虑骨癌痛造模的问题。能够有效并且完整地实现临床骨癌痛在实验动物身上的重现非常重要。特别是关于药物治疗方面，动物模型为此提供非常理想可靠的依据。骨癌痛模型的建立经过了相当漫长的时间，为了模拟临床病人的状况，开始研究者将肿瘤细胞应用在动物身上，随其生长直至发生骨转移，显然此方法是不可取的。首先，转移型骨癌痛发生的时间难以控制，其次在对照实验中难以控制组间变异，给模型的可重复性带来不便。后来研究者将肿瘤细胞在长骨的股骨和胫骨周围尝试造模，由此开始了可重复骨癌痛模型的研究。纤维肉瘤在小鼠骨癌痛模型的应用中开始的最早，在胫骨中造模和肌肉中造模两种对比中，胫骨模型成功。在肌肉中纤维肉瘤虽然形成肿瘤，但是因为肿瘤早期有结缔组织包绕，并未对胫骨骨组织造成破坏，故在之后的造模过程中大多使用骨蜡等将肿瘤细胞封闭在骨髓腔中。之后研究者开始使用其他部位的肿瘤细胞建立转移型小鼠骨癌痛模型都取得了成功。在大鼠模型方面，早期并未使用纤维肉瘤细胞，而是以更易获得的乳腺癌细胞为造模材料，不同类型的乳腺癌细胞在各种大鼠的雌性鼠上都获得成功。后来发展为用其他部位的肿瘤细胞建立骨癌痛模型。直到有研究者开始用雄性大鼠尝试模型获得成功，骨癌痛模型已发展的相当成熟。在研究中，多种肿瘤细胞在大鼠和小鼠中建立骨癌痛模型都获得成功，可推测骨癌痛模型的建立与肿瘤细胞的种类无关，可能与数量有关。特别是胫骨模型，胫骨骨髓腔作为培养基建立的骨癌痛模型，完整，易实现，易重复。骨癌痛动物模型的不断建立，为研究骨癌痛的机制及其止痛和治疗提供了有效的载体。