载脂蛋白E与缺血性脑卒中的相关性研究进展

刘文婷 张卓伯

载脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)是血浆脂蛋白的重要组成成分，在控制脂蛋白和胆固醇代谢的平衡中发挥重要作用。ApoE具有基因多样性(ε2、ε3、ε4)，形成具有不同结构及功能的6种亚型。研究证明，ApoE在多种疾病中承担重要角色，与动脉粥样硬化、冠心病及神经系统多种疾病密切相关。目前有许多研究表明ApoE4极有可能为缺血性脑卒中的危险因素，但受限于多种干扰因素，结论却也不尽相同，故有待进一步的研究，本研究就载脂蛋白E与缺血性脑卒中的关系和可能的作用机制进行综述。

脑卒中是导致神经系统残疾和死亡的首要原因。缺血性脑卒中是由血管、环境、遗传等多因素共同作用的疾病[1]。其中，载脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)基因是被广泛研究的基因之一，主要集中在动脉粥样硬化、冠心病、脑卒中等心脑血管疾病。ApoE基因包括3种等位基因(ApoEε2、ApoEε3、ApoEε4)，编码3种蛋白质亚型(ApoE2、ApoE3、ApoE4)，形成6种遗传表型，其中最常见遗传表型为ε3/ε3，出现在人群中的频率为1/3～1/2[2]。不同ApoE蛋白质亚型与脂蛋白受体可产生不同作用。在肝内它们通过不同的结合、摄取和分解乳糜微粒，从而改变胆固醇以及极低密度脂蛋白(VLDL)的水平。其中，ε4等位基因携带者有较高的血浆胆固醇水平，而ε2等位基因携带者胆固醇水平较低[2]，所以ApoE不同基因型可能影响动脉粥样硬化的发展。据此本研究可以猜想，ApoE是否与缺血性脑卒中等脑血管疾病也有着密切的关系，本研究专注于载脂蛋白E与缺血性脑卒中的相关性研究进展。

1 ApoE和ApoE基因

载脂蛋白为血浆脂蛋白的蛋白质部分，主要分为A、B、C、D、E五类，载脂蛋白在血浆脂蛋白中起着重要作用，即它控制着脂蛋白代谢和胆固醇的平衡。载脂蛋白E(ApoE)被确定为脂蛋白关键成分的时间较晚。在20世纪70年代初ApoE首次被描述为极低密度脂蛋白(VLDL)中的次要载脂蛋白。随后在高胆固醇饮食喂养动物实验中载脂蛋白E被确定为β-VLDL中的主要载脂蛋白，并且不同亚型的高密度脂蛋白(HDL；HDL1，HDLc)也富含载脂蛋白E[3]。 起初该蛋白被称为富含精氨酸的载脂蛋白[3]，在1982年被称为ApoE[3]。

人类ApoE基因位于19号染色体长臂上，像许多可溶性载脂蛋白一样，载脂蛋白E基因含有4个外显子和3个内含子[4]，其中外显子编码的DNA序列存在多态性，即编码112位半胱氨酸(cysteine，Cys)和158位精氨酸(Arginine， Arg)，这导致了3个等位基因的出现[5]，它们在人群中出现的频率为(ε2,5%～10%、ε3,65%～70%、ε4,15%～20%),并且可以产生三种纯合子遗传表型(ApoE2/2,ApoE3/3,ApoE4/4)及三种杂合子遗传表型(ApoE3/2,ApoE4/2,ApoE4/3)。三种基因型的结构基础是112位和158位氨基酸不同(ApoE基因的单碱基变化)：ApoE2在112位和158位都编码Cys，ApoE3在112位编码Cys而158位编码Arg，ApoE4在2个位上均为Arg[3]。包括类人猿在内的其他所有动物都只有单一异构体，即在残基112位和158位上均为精氨酸[3]。

血浆载脂蛋白E主要由肝细胞合成，占人体产生的载脂蛋白E总量的75%。在血脂正常的人体中载脂蛋白E的血浆浓度为4～8 mg/dl[3]；其次ApoE由大脑合成，主要是由星形胶质细胞产生，但也可以由少突胶质细胞、小胶质细胞和神经元产生，特别是受损或紧张的神经元[6]。在大脑中载脂蛋白E是原位合成而不是从外周循环穿过血脑屏障而来。体内的各种细胞包括巨噬细胞也可合成载脂蛋白E[3]。

1.1 ApoE亚型的结构与功能

ApoE是一种由299个氨基酸组成的34 kDa蛋白质，在194位上的苏氨酸(Threonine，Thr)处有1个糖基化位点[4]以及2个由铰链区分开的结构域。 其中氨基末端结构域含有低密度脂蛋白(LDL)受体结合区，羧基末端结构域含有脂质结合区[7]。通过X射线晶体学解析，ApoE2，ApoE3和ApoE4的氨基末端结构域的三级结构由4个反平行排列的螺旋构成，羧基末端结构域具有与脂质结合的两亲α-螺旋[8]。

ApoE3和ApoE4以相似的亲和力与LDL受体结合(比另一种LDL受体配体ApoB100高约20倍)。通过点突变和III型高脂蛋白血症患者中天然存在的受体缺陷，确定了受体结合的关键氨基酸[8]。ApoE是通过介导VLDL、中密度脂蛋白和乳糜微粒残留物的摄取在调节胆固醇稳态中起作用[3]。在ApoE2中158位编码Cys，而在ApoE3和ApoE4中在158位为Arg，所以ApoE2与LDL受体结合缺陷(大约为正常活性的2%)。通过氨基末端结构域的X-射线晶体学所示，158位编码的Cys通过改变136～150位碱性残基侧链的构象来阻止其与正常受体结合。在ApoE3中158位的Arg与154位的天冬氨酸(Aspartic acid，Asp)形成盐桥，然而在ApoE4中因为158位为Cys，不能与154位的Asp相互作用，所以盐桥被破坏，从而改变了整个受体结合区[8]。

ApoE4在112位编码的Arg使61位上的Arg的侧链远离氨基末端结构域，112位编码的Arg便可与255位的谷氨酸(glutamic acid,Glu)羧基末端结构域相互作用,这种特性为ApoE4的结构域相互作用[3]。在ApoE3或ApoE2中发生这种结构域相互作用的可能性较小，因为在这些异构体中61位上的Arg的侧链更多地位于氨基末端的螺旋结构域[8]。但是这种结构域相互作用不是1个全或无的过程，其蛋白质的结构是动态变化的，所以ApoE在结构域相互作用上可能具有一定的梯度倾向(ApoE4>ApoE3>ApoE2)[3]。

1.2 ApoE与动脉粥样硬化

1.2.1 ApoE2

因为ApoE2与LDL受体结合缺陷，所以ApoE2纯合子可导致III型高脂血症。在糖尿病、肥胖、甲状腺功能减退或雌激素缺乏患者体内VLDL生产过盛或LDL受体减少，并且超出了ApoE2介导清除甘油三酯和β-VLDL的能力，也会出现类似情况。ApoE其他显性和隐性突变影响受体结合区域内及其附近的残基，也可导致III型高脂血症[8]。在环境或遗传因素的作用下受体的结合缺陷可诱发高脂血症，并且增加动脉粥样硬化的风险，尤其在外周动脉β-VLDL在血浆中的累积导致胆固醇浓度升高及重度动脉粥样硬化。

1.2.2 ApoE4

ApoE4增加血浆中LDL的水平及动脉粥样硬化的风险[3]。一方面ApoE4优先与大分子脂蛋白(30～80 nm)结合(如富含甘油三酯的VLDL)，而ApoE2、ApoE3则优先结合小分子脂蛋白(如富含磷脂和表面蛋白9～16 nm的球形HDL颗粒，载脂蛋白AI)；另一方面在肝脏高浓度的VLDL与ApoE4通过受体介导的内吞作用加速了它们的清除。因此，LDL受体减少，导致血浆中LDL水平增加[9]。

由240-260位上的羧基末端结构域介导的脂质结合过程中ApoE4中112位的氨基末端结构域Arg与ApoE3、ApoE2中的Cys不同，这种氨基酸的差异通过结构域相互作用改变ApoE4的脂蛋白亲和力。ApoE4是通过小分子阻止Arg-61-Glu-255离子相互作用或定点诱变(61位的Arg变为Thr)，使结构域相互作用中断，从而使ApoE4的结合从VLDL转移到HDL[3]。Nguyen等人的研究证明ApoE4结构域相互作用与磷脂结合能力降低有关，因为结构域相互作用可以稳定延伸的螺旋结构，使其既能够与较大的VLDL相互作用又可以与较小曲率的脂蛋白颗粒的相互作用[10]。

2 缺血性脑卒中

缺血性脑卒中是全球死亡和残疾的主要原因之一[11]。过去认为其危险因素包括血脂异常、高血压病、房颤、吸烟、糖尿病等，这只能解释一小部分的观察临床事件。然而，很大一部分缺血性脑卒中患者的危险因素仍然不明。双胞胎和家族聚集性研究表明，脑卒中的风险有很大的遗传因素[12]。但由于缺血性脑卒中的发病机制尚未完全明确，且检测候选基因的方法限制了发现新易感基因的能力，所以在一般人群中风险基因仍未确定。近年来研究表明，ApoE4似乎因扰乱了脂代谢平衡尤其是影响甘油三酯、胆固醇及LDL的水平而增加冠心病的风险，故ApoE与缺血性脑卒中的关系引起了热议，并展开了一系列的研究。

3 ApoE与缺血性脑卒中

来自大型荟萃分析的证据表明，ApoE与冠心病(CHD)呈正向剂量-反应相关，与观察到的LDL结果一致，支持LDL在CHD中的因果作用。然而，ApoE与缺血性脑卒中风险之间的相关性尚不清楚，不能从CHD相关性中推断出来，只有1个ε4等位基因与缺血性脑卒中高风险相关的初步证据[13]。此外，该分析仅基于ε2和ε4基因携带者，而基于六种ApoE基因型的分析需要估计基因型剂量-反应关系。本研究可以通过ApoE与颈动脉内膜中层厚度(C-IMT)的关联性及C-IMT与缺血性脑卒中的关系，在随机试验中采用无创测量动脉粥样硬化当作替代结果[14]，从而分析ApoE与缺血性脑卒中的相关性。

3.1 ApoE与缺血性脑卒中(IS)的研究进展

ApoE基因与脑卒中的相关研究报道了一些积极的结果，如由Banerjee等人进行的研究显示在统计学上ApoEε4等位基因与脑卒中显著相关[13]。同样，在中国人群中的研究表明ApoEε4增加患进展性脑卒中的风险[15]，并且关于中国北方的汉族人的研究表明高血压病和ε2、ε3、ε4三种等位基因是缺血性脑卒中发病风险的独立危险因素[16]。然而，关于广西汉族人群的研究结果表明ApoE基因多态性与缺血性脑卒中无显著的关系。但是，随后的研究显示，一些基因表型具有显著相关性，如ε2/ε4与ε3/ε3，ε3/ε4与ε3/ε3，ε4/ε4与ε3/ε3以及等位基因ε4与等位基因ε3[17]。目前研究证明，虽然一些特定的基因表型(ε2/ε2与ε2/ε4，ε3/ε3与ε2/ε3，ε3/ε3与ε2/ε4，ε4/ε4与ε2/ε3，ε4/ε4与ε2/ε4)和基因型(ε3与ε4)与缺血性脑卒中无明确相关，但与出血性脑卒中患者有重要联系，并且研究发现缺血性脑卒中与出血性脑卒中在一些基因表型(ε2/ε2与ε2/ε4，ε3/ε3与ε2/ε3，ε3/ε3与ε2/ε4，ε4/ε4与ε2/ε3，ε4/ε4与ε2/ε4)上有明显差异[1]。

有关ApoE基因与缺血性脑卒中亚型关系的相关研究发现其与颅内大血管闭塞、腔隙性脑梗死和心源性脑卒中(CE)显著关联[1]。关于台湾人群的调查显示ε3/ε4基因型与腔隙性脑梗死可能相关，但是与动脉粥样硬化性血栓性脑梗死却无明显相关[18]，并且有关日本人群的研究表明ε2等位基因携带者具有动脉粥样硬化血栓形成、脑出血(ICH)和心源性脑栓塞的危险因素，并且ε4等位基因携带者患动脉粥样硬化血栓形成、脑出血和蛛网膜下腔出血(SAH)的风险较高[19]。

综合以上的研究发现，由于缺血性脑卒中分型较多，危险因素复杂，且不同种族差异较大，故ApoE基因与缺血性脑卒中的关系不易确定。大量研究表明在亚洲人群中ApoEε4等位基因极有可能是缺血性脑卒中的危险因素。

3.2 ApoE与缺血性脑卒中的可能作用机制

为了明确ApoE影响缺血性脑卒中的作用机制，大量研究其可能与之相关的因素，其中包括血脂、炎症、内皮细胞活化以及代谢。

载脂蛋白E的结构和受体结合特性可能对脑血管系统产生强烈的影响。如外周产生的ApoE可以向大脑内皮细胞(brain endothelial cells，BEC)发出信号，并且神经血管单元(neurovascular unit，NVU)的细胞可以表达ApoE和ApoE受体。大量研究表明ApoE亚型特异性差异影响蛋白质折叠包括受体结合结构域(氨基末端)和脂质结合结构域(羧基末端)以及ApoE的稳定性[20]。在中枢神经系统大脑间质液中大部分ApoE是以脂蛋白的形式存在，而ApoE异构体之间的差异将影响脂蛋白的结构。Tai等人的研究提出假设，认为脑中的ApoE亚型之间的结构差异导致ApoE4具有较低的脂化作用，ApoE4-脂蛋白稳定性较低，产生有毒的ApoE4片段，降低ApoE4水平，导致ApoE4细胞再循环受损和受体活性改变[21]。

针对脑血管系统，ApoE特异性调节星形胶质细胞-周细胞-大脑内皮细胞的相互作用。在周细胞中ApoE4(来源于星形胶质细胞)向低密度脂蛋白相关受体蛋白1(LRP1)传递信号受损，从而导致周细胞中亲环蛋白A(cypA)及NFkB-基质金属-蛋白酶9(MMP9)途径的高活性[22]。MMP9水平的升高，通过基底膜降解和脑内皮细胞功能受损，导致脑血管形成功能障碍。重要的是，ApoE异构体通过LRP1和RhoA途径特异性调节周细胞运动。由大脑分泌的ApoE可以激活大脑内皮细胞中的ApoE受体来调节脑血管功能，这一作用总是被忽略。事实上，在大脑内皮细胞中因为ApoE3的作用比ApoE4更大，所以来源于星形胶质细胞的ApoE经LRP1通路导致了ApoE4的蛋白磷酸化降低[23]。除了激动剂活性之外，在血管性痴呆中观察到的毒性ApoE4片段在脑内皮细胞内的积累也可诱导脑血管功能障碍。因此，与星形胶质细胞、周细胞和脑内皮细胞中的ApoE3相比，ApoE4受体信号级联反应可能会变慢，从而导致脑血管破坏。

广泛研究认为，ApoE4与Aβ非依赖性神经炎症和Aβ依赖性神经炎症的有害反应相关[24]。然而，由于慢性神经炎症的复杂性，包括时间特异性和细胞特异性发生的多种有害和有益的效应，几乎使每种炎性介质的功能数据相互冲突，而ApoE4诱导的有害神经炎症表型，其特征在于高浓度促炎细胞因子和低浓度抗炎细胞因子[24]，并且许多炎性介质在脑血管系统(脑血管内皮细胞功能、血管生成和基底膜)中起到了重要的作用。ApoE4引起脑血管损伤一部分是通过上述的ApoE信号传导来介导对神经胶质炎症的作用，一部分ApoE是通过对脑内炎性细胞释放的可溶性介质的作用，从而抵御外界的打击[23]。

4 机遇与挑战

近年来随着各种科学技术的不断提高，人类对ApoE基因的研究愈发的深入，证明了从动脉粥样硬化、冠心病到神经系统疾病等众多疾病都和ApoE基因多样性有着密切的关系。ApoE基因的研究经历了漫长的过程，也产生了许多学说，尤其在ApoE基因与脑卒中方面，但至今尚无统一确定的答案。随着对ApoE基因研究的不断深入以及联合其他科学新技术的应用，ApoE基因对脑卒中的影响以及机制将得到更加科学的解释，并且以期能够在脑卒中的预防、诊断及治疗中发挥重要作用。