近红外光谱技术快速测定杞菊地黄丸中马钱苷的含量

刘建营,白 雁,雷敬卫

(1.驻马店市中心医院药学部，驻马店 463000；2.河南中医药大学药学院，郑州 450046)

杞菊地黄丸(浓缩丸)主要由枸杞、菊花、熟地黄、山茱萸(制)、牡丹皮、山药、茯苓和泽泻组成，具有滋肾养肝、增强免疫力、抗衰老、改善肝脏脂肪代谢和促进肝细胞新生的功效，主治肝肾阴亏、眩晕耳鸣、羞明畏光和迎风流泪等症[1-3]。马钱苷为杞菊地黄丸中的主要有效成分，具有调节免疫、抗炎、抗休克等作用[4-5]。现在多数标准对杞菊地黄丸中马钱苷的含量测定采用HPLC法，该方法需对样品做较为复杂的前处理，且消耗大量有机试剂。近红外光谱技术(NIR)作为一种应用性分析方法，近年来发展迅速,该技术具有分析速度快、操作简便和低消耗等独特优势[6-9]。本实验利用近红外光谱技术结合化学计量学方法，实现了对杞菊地黄丸中马钱苷的快速分析。

1 仪器与试药

1.1仪器 Thermo Nicolet 6700型近红外光谱仪(配有OMNIC光谱采集软件和TQ 8.0分析软件)(美国赛默飞世尔公司)；Waters 2695高效液相色谱仪，Waters 2996二极管阵列检测器，Reo-Pure 75LPIM超纯水器(美国沃特世公司)；METTLER AE-200型电子天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)；SK3300LH型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；高速药材粉碎机(郑州裕强机械设备有限公司)。

1.2试药 河南宛西制药有限公司提供的113份不同批次的杞菊地黄丸样品，粉碎，过80目筛，备用；色谱纯:甲醇(天津四友试剂有限公司)，乙腈(天津市科密欧化学试剂开发中心)；磷酸(分析纯，天津凯通试剂有限公司)；马钱苷对照品(供测定含量用，批号121072-201109)，购自中国食品药品检定研究院。

2 方法

2.1采集近红外光谱数据 113份杞菊地黄丸样品，各取8 g，置于石英杯中。实验室温度为21～29 ℃，相对湿度为45%～62%。近红外光谱仪参数设置为：测样方法为积分球漫反射，扫描波段为12 000～4 000 cm-1，分辨率为8 cm-1，扫描次数为64次。每份样品重复测定5次，计算出平均光谱，用于建立模型。杞菊地黄丸样品的近红外光谱叠加图见图1。

图1杞菊地黄丸的近红外光谱图

Fig.1 NIR spectra of Qijudihuang Pills

2.2马钱苷的含量测定

2.2.1马钱苷对照品溶液的制备 取马钱苷对照品适量，精密称定，加体积分数为70%的甲醇溶液制成质量浓度为60 μg·mL-1溶液，备用。

2.2.2杞菊地黄丸供试品溶液的制备 取杞菊地黄丸粉末1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入体积分数为70%的甲醇25 mL，密塞，称定质量，加热回流1 h，放冷，再称定质量，用体积分数为70%的甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10 mL，加在中性氧化铝柱(100～200 目，4 g，内径为1 cm)上，用体积分数为60%的甲醇50 mL洗脱，收集流出液与洗脱液，蒸干，残渣用体积分数为70%的甲醇溶解，移至5 mL量瓶中，加体积分数为70%的甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得[1]。

2.2.3色谱条件 色谱柱型号为Sunfire C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为甲醇∶乙腈∶1 mL·L-1磷酸溶液(4∶11∶85);等度洗脱；流速为1.5 mL·min-1；柱温为40 ℃；进样体积为10 μL；检测波长为240 nm。按照上述色谱条件进样测定，所得杞菊地黄丸HPLC图见图2。

图2HPLC图

A．对照品；B.样品；1.马钱苷。

Fig.2 HPLC chromatograms

A．control；B.sample；1.loganin.

2.2.4样品中马钱苷的含量测定 按照2.2.3项下色谱条件测定113份杞菊地黄丸中马钱苷的含量，每份样品平行测定3次，求得平均值。113份样品马钱苷的含量范围为1.18～1.85 mg·g-1。

3 模型的建立与验证

3.1杞菊地黄丸中马钱苷定量分析模型的建立

3.1.1校正集与验证集的选择 以验证集的马钱苷含量分布范围在校正集的马钱苷含量范围之内为原则，使用TQ 8.0定量分析软件中偏最小二乘法建立模型。根据杞菊地黄丸中马钱苷的含量分布情况，从113份样品中选取86个有代表性的样品(马钱苷含量范围为1.17～1.85 mg·g-1)组成校正集，27个样品(马钱苷含量范围为1.21～1.82 mg·g-1)为验证集，对模型进行内部交叉验证。

3.1.2光谱范围及预处理方法的选择 近红外光谱为O-H、N-H、C-H等基团伸缩振动的倍频和组频吸收，其图谱中各峰重叠严重，用常规的线性分析方法无法分析[10-13]。因此，使用化学计量学中PLS法建立模型，以校正均方差、交叉检验决定系数、交互验证均方差、预测相关系数和预测均方差等参数来确定最优模型[14-16]。对于同一样品集所构建的近红外定量校正模型，相关系数越大、均方差越小，所建模型适用性越强、预测效果越好[17-19]。经筛选比较，最终确定一阶导数+标准正态变量为光谱进行预处理方法，7 465.17～4 111.36 cm-1为最佳波段范围，见表1和图3。

表1不同预处理方法优化的校正模型结果

Tab.1 The optimized results with different preprocessing methods

光谱预处理方法交叉检验决定系数校正均方差一阶导数+标准正态变量0.99860.0426二阶导数+标准正态变量0.92170.0766一阶导数+多元散射校正0.67990.1470二阶导数+多元散射校正0.97860.0851一阶导数+多元散射校正+Norris平滑0.57340.4130二阶导数+多元散射校正+Norris平滑0.84140.1150一阶导数+多元散射校正+Savitzky-Golay平滑0.69370.2380二阶导数+多元散射校正+Savitzky-Golay平滑0.85440.7640一阶导数+标准正态变量+Savitzky-Golay平滑0.76980.1190二阶导数+标准正态变量+Savitzky-Golay平滑0.89680.4530一阶导数+标准正态变量+Norris平滑0.76480.1570二阶导数+标准正态变量+Norris平滑0.74480.2360

图3杞菊地黄丸NIR一阶导数图谱

Fig.3 NIR first derivative of Qijudihuang Pills

3.1.3主因子数的选择 建模过程中，主因子数决定着模型的复杂程度和预测能力[19]。本实验中，以7为主因子数建模时，马钱苷校正模型的交互验证均方差为0.093 4，为最小，见图4。

3.1.4杞菊地黄丸中马钱苷定量分析模型的建立 当以113份样品中86份组成校正集，27份验证集，一阶导数+标准正态变量为光谱进行预处理方法，7 465.17～4 111.36 cm-1为最佳波段范围，7为主因子数建模时，马钱苷校正模型的交叉检验决定系数r=0.998 8，校正均方差RMSEC为0.041 6，各项参数评价良好。此时NIR预测值与参考值的相关图见图5。

图4主因子数对模型交互验证均方差的影响

Fig.4 The influence of root mean square error of cross-validation value with different factors

图5NIR预测值与参考值的相关性

Fig.5 Correlation between NIR predicted and actual values

3.2NIR定量模型的外部验证 采集15份杞菊地黄丸验证集样品的近红外图谱，将其导入马钱苷定量分析模型中，得到马钱苷含量的预测值。将马钱苷模型预测值与HPLC法测得值进行相关分析，结果显示，马钱苷的预测相关系数r=0.986 7，预测均方差RMSEP为0.084 9，结果表明，模型可准确测定杞菊地黄丸中马钱苷的含量。

4 结论

本实验使用近红外光谱技术为杞菊地黄丸(浓缩丸)建立了马钱苷含量的近红外定量分析模型。近红外光谱技术是一种间接分析技术，其定量分析模型的准确性是建立在大量具有代表性样品的精准测定及模型后期持续不断的完善之上。在建立过程中，所选样品代表性越强，模型的实用性就越强，这需花费大量的时间和精力。模型建成后，只需扫描获得杞菊地黄丸样品的近红外图谱，输入模型即可直接测得杞菊地黄丸中马钱苷的含量，为其质量评价提供快速、无污染的方法。本实验使用的样品由单一厂家提供，所建模型仅限于该厂家杞菊地黄丸的使用，不可应用于其他厂家。在以后的实验中，可根据实际需求，完善不同厂家、不同批次杞菊地黄丸近红外模型的建立，更好地服务于生产。

[1] 国家药典委员会．中国药典：2015年版：一部[S]．北京：中国医药科技出版社，2015：936-937.

[2] 翟宏焱，颜晓航.毛细管气相色谱法测定杞菊地黄丸(浓缩丸)中丹皮酚含量[J].安徽医药，2008，12(11)：1043-1045.

[3] 马宏杰，李月灵，曹双胜.杞菊地黄丸治疗不同角膜屈光术后干眼的临床研究[J].中国中医眼科杂志，2017，27(3):150-153.

[4] 李小娜．山茱萸有效成分的提取分离与药物代谢动力学研究[D]．石家庄：河北医科大学，2007：15-17．

[5] 郑风敏，刘会艳.HPLC法测定杞菊地黄丸(浓缩丸)中马钱苷的含量[J].北方药学，2015，12(10):5-6.

[6] 叶俊华，刘立鹏，夏阿林，等．在线近红外光谱分析仪的研制及应用[J]．仪器仪表学报，2009，30(3)：531-535．

[7] 刘荔荔,邢旺兴，贾媛，等.近红外漫反射光谱法测定西洋参中人参的掺入量[J],中国中药杂志,2003,28(2):178-179.

[8] 薛利红，杨林章.基于可见近红外高光谱的菠菜硝酸盐快速无损测定研究[J].光谱学与光谱分析，2009，29(4)：926-930.

[9] 冯新沪，史永刚.近红外光谱及其在石油产品分析中的应用[M].北京:中国石化出版社，2002：4-5.

[10]严衍禄．近红外光谱分析基础与应用[M]．北京：中国轻工业出版社，2005：75-76．

[11]褚小立，袁洪福，陆婉珍．近红外分析中光谱预处理及波长选择方法进展与应用[J]．化学进展，2004，16(4)：528-532．

[12]洪明坚，温泉，温志渝.一种基于蒙特卡罗方法的近红外波长选择算法[J].光学学报，2010，30(12):3637-3642.

[13]李岩梅，国警月，陈庆先，等.近红外漫反射光谱法非破坏分析颠茄粉末药品质量[J].生命科学仪器，2009，8:50-52.

[14]吴卫涛.复方丹参滴丸近红外一致性检验模型的建立与考察[J].中国实用医药，2011，6(29):170-171.

[15]徐晓杰，宋丽丽，朱新科，等．近红外光谱法用于六味地黄粉末混合过程的质量控制研究[J]．中国现代应用药学，2006，23(7)：644-646．

[16]王宁，蔡绍松，武卫红，等．一种基于声光可调滤光器-近红外光谱技术的复方丹参片快速定性分析方法[J]．中国中药杂志，2008，33(16)：1964-1968．

[17]褚小立，袁洪福，陆婉珍.光谱多元校正中的模型传递[J].光谱学与光谱分析，2001，21(6):881-885.

[18]黄洁，周娜,王苑桃，等.氯硝西泮片近红外光谱定量模型的建立与应用[J]．西北药学杂志，2016，31(6):587-590.

[19]陆婉珍．现代近红外光谱分析技术[M]．第二版.北京：中国石化出版社，2007：44-87．