HPLC双波长法同时测定意大利牛舌草中3种成分的含量

郭 伟,滕 亮,万琪臻,马桂芝*

(1.新疆医科大学药学院,乌鲁木齐 830011；2.新疆医科大学第一附属医院药学部,乌鲁木齐 830054；3.新疆医科大学第一附属医院昌吉分院,昌吉 831100)

意大利牛舌草(AnchusaitalicaRetz.)维吾尔文名为高孜万或高孜班,是紫草科(Boraginaceae)多年生草本植物。作为一种重要的药用植物,意大利牛舌草在民间使用具有悠久的历史，其性湿热,主要功能为清热解毒、健胃舒肝,也可用于治疗咳嗽痰喘、食欲不振、头晕头痛和高血压[1]。维吾尔医学理论认为,意大利牛舌草具有生湿生热、调剂异常黑胆质、生湿补脑、祛寒补心、爽心悦智、润燥消炎和止咳平喘等功效[2-3],为维吾尔医学治疗冠心病组方的高频药[4-5]。意大利牛舌草中可能含有甾体、三萜类、挥发油、酚类、鞣质、黄酮类、香豆素、内酯类、生物碱、糖类、氨基酸、蛋白质及皂苷类化合物等化学成分[6-10]。其中咖啡酸、芦丁和紫云英苷均有一定的药理活性[11-13]。

目前意大利牛舌草的质量控制手段主要采用显微、理化鉴别和单一成分液相测定的方法评价其质量的优劣,有一定的片面性[14-17]。为了更好地控制药材质量,本文建立了同时测定意大利牛舌草中咖啡酸、芦丁和紫云英苷3种成分含量的HPLC法,该方法操作简便、重复性好、准确度高,为意大利牛舌草的质量控制提供了实验依据。

1 仪器与试药

1.1仪器 1220 Infinity 高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；New Classic MF电子天平(梅特勒-托利多公司)；Milli-Q艾柯超纯水仪(美国密理博公司)；SK2510HP超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)。

1.2试药 对照品：咖啡酸(批号110885-200102),购自中国食品药品检定研究院；芦丁(批号MUST-16031813,质量分数≥98.0%),购自成都曼思特生物科技有限公司；紫云英苷(批号Y27J7H9634,质量分数≥98.0%),购自上海源叶生物科技有限公司。乙腈、甲醇(色谱纯,美国Fisher公司)；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。意大利牛舌草药材(批号20160705,产地：巴基斯坦),购自新疆买提牙孜生物科技有限公司,由新疆医科大学药学院帕丽达·阿布力孜教授鉴定为紫草科(Boraginaceae)多年生草本植物意大利牛舌草(AnchusaitalicaRetz.)的地上部分。

2 方法与结果

2.1色谱条件 π NAP COSMOSIL C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)。以乙腈(A)-2 mL·L-1磷酸(B)为流动相,梯度洗脱[0～10 min,85%B；10～15 min,85%B→80%B；15～25 min,80%B→70%B；25～33 min,70%B→45%B；33～40 min,45%B→85%B]。流速为1.0 mL·min-1；柱温为30 ℃；紫云英苷、咖啡酸和芦丁的检测波长分别为266,341和341 nm；进样量为10 μL。色谱图见图1。

图1HPLC图

A.混合对照品溶液(266 nm)；B.混合对照品溶液(341 nm)；C.供试品溶液(266 nm)；D.供试品溶液(341 nm)；1.咖啡酸；2.芦丁；3.紫云英苷。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.mixed standards (266 nm)；B.mixed standards (341 nm)； C.sample (266 nm)；D.sample (341 nm)；1.caffeic acid；2.rutin；3.astragaline.

2.2对照品溶液的制备 取对照品咖啡酸、芦丁和紫云英苷适量,精密称定,加入甲醇使其完全溶解,分别制得对照品溶液。分别精密量取各对照品溶液适量,加甲醇稀释至咖啡酸、芦丁和紫云英苷的质量浓度分别为22.4,115.8和 78.4 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.3供试品溶液的制备 取意大利牛舌草药材粉末2.5 g,精密称定,置于100 mL具塞锥形瓶中,加入体积分数为90%的甲醇50 mL,称定质量,50 ℃、300 W超声提取30 min,放冷,再称定质量,用体积分数为90%的甲醇补足减失的质量,摇匀,上清液以0.22 μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。

2.4线性关系的考察 精密量取混合对照品溶液,依次倍量稀释,得到系列质量浓度的混合对照品溶液。分别精密吸取10 μL注入液相色谱仪,按照2.1项下色谱条件进行测定。以峰面积y对质量浓度x(μg·mL-1)进行线性回归,咖啡酸、芦丁和紫云英苷3种化合物的回归方程分别为：y=683 058.284 1x-41 551.603 5,r=0.999 9；y=272 380.388 2x-51 335.028 7,r=0.999 9和y=463 478.798 7x-18 188.954 0,r=0.999 8；线性范围分别为：0.348 8～23.32,1.813～116.0和0.241 3～15.44 μg·mL-1。结果表明,3种成分在相应质量浓度范围内峰面积与质量浓度线性关系良好。

2.5精密度实验

2.5.1日内精密度 吸取高、中和低3个质量浓度的混合对照品溶液(其中咖啡酸的质量浓度分别为0.348 8,1.395和23.32 μg·mL-1；芦丁的质量浓度分别为1.813,7.251和116.0 μg·mL-1；紫云英苷的质量浓度分别为0.241 3,0.965和15.44 μg·mL-1)。按照2.1项下色谱条件连续进样6次。咖啡酸高、中和低质量浓度峰面积的RSD值分别为0.07%,0.85%和1.59%；芦丁高、中和低质量浓度峰面积的RSD值分别为0.08%,0.27%和1.13%；紫云英苷高、中和低质量浓度峰面积的RSD值分别为0.66%,0.49%和1.86%,结果表明,该方法日内精密度良好。

2.5.2日间精密度 吸取2.5.1项下高、中和低3个质量浓度的混合对照品溶液,连续测定3 d。咖啡酸高、中和低质量浓度峰面积的RSD值分别为0.73%,0.89%和1.87%；芦丁高、中和低质量浓度峰面积的RSD值分别为0.62%,0.23%和1.68%；紫云英苷高、中和低质量浓度峰面积的RSD值分别为1.26%,0.26%和1.38%。结果表明,该方法日间精密度良好。

2.6重复性实验 按照2.3项下方法平行制备6份供试品溶液,按照2.1项下色谱条件进行测定,测得样品中咖啡酸、芦丁和紫云英苷3种化学成分含量的RSD值分别为2.16%,1.88%和3.19%,结果表明,该方法重复性较好。

2.7稳定性实验 取同一样品溶液,分别在0,1,3,5,7,9,12和24 h测定。按照2.1项下色谱条件进行测定,测得咖啡酸、芦丁和紫云英苷峰面积的RSD值分别为1.30%,1.74%和1.50%。结果表明,该溶液在24 h内较稳定。

2.8平均回收率 精密称取已知含量的意大利牛舌草粉末2.5 g,9份,分别加入咖啡酸、芦丁和紫云英苷对照品溶液适量。按照2.3项下方法制备供试品溶液,按照2.1项下色谱条件进样,依次测得咖啡酸、芦丁和紫云英苷的平均回收率和RSD值,见表1。结果表明,该方法准确度良好。

2.9样品含量测定 取不同批号的意大利牛舌草粉末2.5 g,各3份,按照2.3项下方法制备供试品溶液,按照2.1项下色谱条件进行测定。结果见表2。

表1加样回收率实验结果

Tab.1 Results of recovery test

成分称样量/g样品含量/μg加入量/μg测得量/μg回收率/%平均回收率/%RSD/%咖啡酸2.4789210.6196.8405.799.299.61.282.4997212.4196.8403.897.52.5009212.5196.8409.9100.32.5014212.5196.8408.899.72.5018212.6196.8412.1101.32.5017212.6196.8408.199.4芦丁2.47891641.21451.43111.8101.2101.10.662.49971654.91451.43123.9101.12.50091655.71451.43128.8101.32.50141656.11451.43115.3100.52.50181656.31451.43144.7102.22.50171656.31451.43113.9100.4紫云英苷2.4789152.3135.2285.298.499.83.752.4997153.6135.2297.3105.52.5009153.7135.2282.495.82.5014153.7135.2293.9103.22.5018153.7135.2286.098.02.5017153.7135.2285.397.6

表23种样品含量测定结果

Tab.2 Determination results of 3 compounds

样品编号咖啡酸/μg·g-1芦丁/μg·g-1紫云英苷/μg·g-1DS184.96±1.12662.05±10.0461.45±2.45DS285.82±2.64779.59±21.5970.20±0.51DS385.68±1.75779.60±15.5061.45±1.15

3 讨论

3.1流动相的选择 稳定的色谱条件是进行含量测定的基础。本文分别考察了甲醇-2 mL·L-1磷酸、甲醇-2 mL·L-1甲酸、乙腈-2 mL·L-1甲酸、1 mL·L-1甲酸乙腈-1 mL·L-1甲酸、2 mL·L-1甲酸乙腈-2 mL·L-1甲酸以及乙腈-2 mL·L-1磷酸等溶剂系统作为流动相,其中以乙腈-2 mL·L-1磷酸为流动相,意大利牛舌草中3种化学成分具有良好的分离效果和较好的峰形,保留时间适中,最终选择乙腈-2 mL·L-1磷酸为流动相[16]。

3.2检测波长的选择 本文分别对药材中含有的2种黄酮类成分芦丁和紫云英苷进行紫外全波长扫描,两者均具有黄酮类化合物桂皮酰系统和苯甲酰系统组成的交叉共轭体系形成的2个紫外吸收带的特征：芦丁的最大吸收波长为266和409 nm；紫云英苷的最大吸收波长为266和341 nm；咖啡酸的最大吸收波长在320 nm附近[18]。综合考虑,在266 nm处检测紫云英苷,在341 nm处检测咖啡酸和芦丁,使得各成分均有较大吸收。

3.3供试品制备工艺的选择

3.3.1提取方法 分别采用回流、冷浸和超声方法进行供试品溶液的制备,结果表明,超声提取法可获得较高的提取率,且方法简单、经济、省时、易行。

3.3.2提取溶剂 考察不同质量浓度甲醇、乙醇对制备工艺的影响,当提取溶剂中水的比例超过30%时,提取液黏稠而难以过滤,且液相测定时易堵塞色谱柱。采用不同比例的醇提取后,蒸干,加醇复溶处理,可使提取液中多糖等黏性物质析出,但过程复杂,重复性差。最终确定用体积分数为90%的甲醇提取,咖啡酸、芦丁和紫云英苷均可获得较高的提取率。

方法学研究结果表明,采用HPLC法同时测定意大利牛舌草中咖啡酸、芦丁和紫云英苷3种化学成分的含量,具有良好的精密度、准确度和重复性,简单易行,可为意大利牛舌草的药材质量评价提供理论依据。

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