一种乳酸杆菌-玉竹多糖合生元的制备工艺研究

邓丽娜*，袁 斐

（1．张家港市中医院，江苏 苏州 215600；2．南京中医药大学翰林学院，江苏 泰州 225300）

合生元是有益菌和益生元相结合的生物制剂，合生元具有调节人或动物肠道微生态环境，增强免疫力和消化能力的作用[1]。益生菌在肠道内能够抑制有害微生物的生长，增强非特异性免疫功能来预防疾病。益生元则可以选择性地促进定值于肠道内的微生物的生长，调节肠道菌群结构，改善宿主的消化能力，促进宿主健康[2-3]。通常合生元的有两种类型：配伍型合生元与发酵型合生元。配伍型合生元是将益生菌和益生元按照一定比例配伍制备得到。这种合生元可以保证益生菌和益生元各自的稳定性，但其活性无法得到保证；发酵型合生元是将益生元与益生菌进行体外混合发酵，发酵产物作为合生元饲喂动物。这种合生元可以充分发挥益生菌和益生元各自的特点与优势，两者相互促进，协同发挥作用，其效果往往比配伍型合生元要好[4-5]。

近年来，中药在合生元制备领域表现出较好的研究前景。很多研究者发现中药中的活性物质，如多糖类、皂苷类、三萜类等成分具有明显的益生活性，不仅能促进益生菌的生长，同时也能发挥调节肠道微生态的作用[6-7]。玉竹为百合科植物玉竹Polygonatum odoratum （Mill.）Druce的干燥根茎。性微寒，味甘平，归肺、胃经。具有养阴润燥，生津止渴之功[8]。现代药理学研究表明，玉竹中的多糖类成分是其发挥药理作用的主要有效成分之一。玉竹多糖具有较好的抗氧化、调节免疫、增强动物耐缺氧能力的作用[9-12]。近年来，以中药多糖类成分作为益生元与乳酸杆菌共同发酵制备合生元的研究越来越多。有学者将黄芪多糖与乳杆菌共发酵制备黄芪多糖合生元，饲养小鼠结果表明，该合生元能显著提升小鼠免疫能力。

本实验旨在研究玉竹多糖-乳酸杆菌体外合生发酵的条件进而制备合生元，为玉竹多糖合生元饲料添加剂的开发提供基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

玉竹购于江苏海昌中药集团。经南京中医药大学陈建伟教授鉴定为百合科植物玉竹Polygonatum odoratum（Mill.）Druce的干燥根茎。样品采集后进行分拣处理，保存于干燥阴凉处。

1.2 实验方法

1.2.1 玉竹多糖的制备

称取玉竹干燥样品2.0 kg，按照1:10（m/V）比例加入石油醚脱脂两次，脱脂后样品烘干，加入10倍量的80%乙醇，80 ℃水浴回流提取2 h，趁热滤过，滤渣用热的80%乙醇，洗涤2～3次，滤渣干燥后，加入10倍量的纯水于150℃加热回流，提取两次，2 h/次，合并提取液。减压浓缩水提液至适当体积，缓慢加入无水乙醇，使含醇量达到80%，4℃静畳过夜，离心，得上清滤液和沉淀，沉淀即为玉竹粗多糖。

称取粗多糖100 g，溶解于1.0 L纯水中，得多糖水溶液。称取三氯乙酸100 g，溶解于纯水中，制成5%三氯乙酸溶液。将粗多糖和三氯乙酸溶液按体积比1:1混匀，4℃静畳过夜，离心取上清，再加入和上清液同体积的三氯乙酸溶液，进行二次除蛋白。将除完蛋白后的多糖溶液减压浓缩至一定体积，缓慢加入无水乙醇，使其含醇量达80%，于4℃静置过夜后，用布氏漏斗抽滤，得到的沉淀即为除去蛋白后的多糖。将该沉淀溶于去离子超纯水中，经AB-8型大孔吸附树脂吸附，进行脱色、除杂处理，冷冻干燥后即得玉竹水溶性多糖（YZP）。

1.2.2 乳杆菌生长曲线及种子液培养时间的确定

无菌操作台中，用接种环将保存在固体培养基上的乳杆菌挑取出一环到含有100 ml MRS培养基的250 mL锥形瓶中，在30℃、180 r/min的恒温振荡器中培养，每隔2 h取样一次，2 mL/次，菌液于6000 r/min离心后弃去上清液，沉淀加入等体积的蒸馏水混匀，在600 nm下测定其菌悬液的相对吸光度OD值，平行三次。以时间（h）为横坐标，OD值为纵坐标绘制乳杆菌24 h生长曲线，确定种子液的培养时间。

1.2.3 乳杆菌培养初始pH值的确定

将MRS培养基在灭菌前用1 mol/L的NaOH或HCl调节pH值分别为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，各培养基按照100 ml的装液量分别装入250 mL锥形瓶中，121℃灭菌20 min。无菌操作台中，用接种环将保存在固体培养基上的乳杆菌接到含有100 mL MRS培养基的250 mL锥形瓶中，按照2.3.3项下筛选出的最佳活化时间培养。然后按2%的接种量分别接种到不同pH值的MRS培养基中，放入30℃的恒温振荡器中培养，每隔4 h取样一次，2 mL/次，菌液于6000 r/min离心后弃去上清液，沉淀加入等体积的蒸馏水混匀，在600 nm下测定其菌悬液的相对吸光度OD值，平行三次。以时间（h）为横坐标，OD值为纵坐标绘制乳杆菌在不同初始PH值下的生长曲线，优选出最佳培养PH值。

1.2.4 乳杆菌接种量的确定

无菌操作台中，用接种环将保存在固体培养基上的乳杆菌接种到MRS培养基中活化，然后按照不同接种量（1%、2%、4%、6%）接种到最优pH值的MRS培养基中，放入到30℃的恒温振荡器中培养，每隔2 h取样一次，每次2 ml，菌液于6000 r/min离心后弃去上清液，沉淀加入等体积的蒸馏水混匀，在600 nm分光光度计下测定其菌悬液的相对吸光度OD值，平行三次。以时间（h）为横坐标，OD值为纵坐标绘制乳杆菌在不同接种量下的生长曲线，优选出最佳接种量。

1.2.5 乳杆菌培养温度的确定

无菌操作台中，用接种环将保存在固体培养基上的乳杆菌接到含有100 ml MRS培养基的250 mL锥形瓶中，按照最佳活化时间培养活化，然后按最适的接种量接种到MRS培养基中，分别放入到恒温振荡器中，于30℃、34℃、37℃和40℃的条件下振荡培养（180 r/min），每隔2 h取样一次，2 mL/次，菌液于6000 r/min离心后弃去上清液，沉淀加入等体积的蒸馏水混匀，在600 nm下测定其菌悬液的相对吸光度OD值，平行三次。以时间（h）为横坐标，OD值为纵坐标绘制乳杆菌在不同温度下的生长曲线，筛选出最佳培养温度。

1.2.6 玉竹多糖最适添加量和最适培养时间的确定

在基础SDM培养基上分别加入不同比例的YZP，使其浓度分别为2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 g/L。各培养基按照100 mL的装液量分别装入250 mL锥形瓶中，121℃灭菌20 min。按照上述筛选的培养条件接种后放入恒温振荡培养箱中培养，每隔4 h取样一次，2 mL/次，菌液于6000 r/min离心后弃去上清液，沉淀加入等体积的蒸馏水混匀，在600 nm下测定其菌悬液的相对吸光度OD值，平行三次。以时间（h）为横坐标，OD值为纵坐标绘制乳杆菌的生长曲线，筛选出两种多糖的最适添加量和最适培养时间。

2 结 果

2.1 乳杆菌生长曲线及种子液培养时间的确定

乳杆菌CICC20261的生长曲线可以看出，在0～8 h之间，乳杆菌生长缓慢，8～12 h之间生长迅速，而在12 h后，生长趋于平缓，此时乳杆菌处于生长的稳定期，此时菌液活菌数高，菌液浓度大。因此，12 h可以作为乳杆菌CICC20261种子液的培养时间。

2.2 乳杆菌在不同PH中的生长曲线

不同pH值下乳杆菌的生长情况可以看出，培养基的初始pH值对乳杆菌的生长影响较大，在pH 3.5～4.5时，乳杆菌的生长受到抑制。同样，偏碱性的环境对乳杆菌的生长也有抑制，在pH大于7.5时，乳杆菌的生长趋势明显小于在pH4.5～7.0之间。通过比较发现，在pH5.0时乳杆菌的生长趋势最好，因此确定适宜的初始pH值为5.0。

2.3 乳杆菌在不同接种量下的生长趋势

不同接种量下乳杆菌的生长曲线可以看出，随着接种量的提高，乳杆菌的在12 h内的OD值是不断增大的。接种量为4%的OD值与接种量为6%的OD值差异并不明显，从节省接种量的方面考虑，确定最适宜的接种量为4%。

2.4 乳杆菌在不同温度下的生长曲线

不同培养温度下乳杆菌的生长曲线可以看出，在34℃下乳杆菌的生长趋势最好。因此，选择34℃为乳杆菌的最适宜培养温度。

2.5 乳杆菌在不同多糖浓度下的生长曲线

乳杆菌在不同浓度的YZP下的生长曲线可以看出，随着YZP浓度的增加，在培养的前6 h期间，乳杆菌的生长随着多糖浓度的增加而增加。培养6h后，乳杆菌的生长趋于平缓。从节省YZP的用量和缩短培养时间的角度考虑，确定YZP的最佳加入量为6.0 g/L，培养时间为10h。

2.6 合生元产品的制备及其活菌数的检测

把培养好的菌液按1 L菌液：0.5 kg麸皮的比例用干燥细麸皮吸附，在45℃烘箱中烘干即得乳酸菌-玉竹多糖合生元。利用平板计数法对合生元活菌数进行检测，结果为4×109cfu/g左右。

3 讨 论

合生元的效果取决于是否选择一个好菌种，取决于是否选对与益生菌具有协同作用的益生元。本实验采用乳酸菌CICC20261及玉竹多糖分别作为益生菌和益生元进行共发酵制备合生元。实验结果表明玉竹多糖对乳酸菌具有良好的促生长作用，可以用于合生元的发酵制备，是良好的益生元。

为了确定乳酸菌-玉竹多糖合生元的最佳发酵工艺，本实验通过考察乳杆菌CICC20261的最适生长条件，确定了乳杆菌的最佳活化培养时间为12 h，初始培养基pH值为5.0，接种量为4%，培养温度为34℃。在此基础上考察了玉竹多糖的最佳加入量和培养时间，玉竹多糖加入量为6 g/L，培养时间为10 h。最终在优选的培养条件下，制备了玉竹多糖合生元。本试验将发酵好的菌液以细麸皮作为载体进行吸附后在45℃烘干制成干燥的细粉状产品，并闻到类似乳酸菌发酵制品典型的味道，符合对益生菌制剂产品的性状检测方面的要求。本实验通过考察玉竹多糖与乳酸菌的共发酵培养条件，确定了发酵培养的最佳工艺，为玉竹多糖合生元的开发提供了科学依据。