Nkx2-5与窦房结发育及相关转录调控因子

2018-01-12 10:20:08杨安康谌晶晶黄从新
关键词:窦房结心肌细胞胚胎

杨安康 谌晶晶 黄从新

Nkx2-5是NK型同源盒基因家族Nkx2型成员 ,最初人们是通过果蝇克隆出NK型同源盒基因,继之分离出与果蝇背侧血管/心脏发育密切相关的Nk-2型基因-tinman,Nkx2-5与tinman高度同源,属于脊椎动物心脏前体细胞分化的早期标志之一 。

最近Protze等[1]通过对发育信号通路进行阶段性调控,使人类多功能干细胞产生了窦房结样起搏细胞。该研究基于Nkx2-5表达与否将心肌细胞进行分类,结果显示与表达Nkx2-5(Nkx2-5+)的心室肌细胞相比,不表达 Nkx2-5(Nkx2-5-)的细胞与窦房结起搏细胞相关基因如Tbx18、Shox2、Tbx3以及Isl1表达水平显著增高,起搏相关离子通道如超极化激活环核苷酸门控通道4型(HCN4)、超极化激活环核苷酸门控通道1型(HCN1)表达水平增高,Shox2+和Tbx3+的细胞比例也增高。该研究为何将Nkx2-5表达与否作为分类依据,Nkx2-5与窦房结发育到底存在何种关系,探究之间的关系或许可以为生物起搏研究提供新思路。

1 Nkx2-5与窦房结发育

Nkx2-5与胚胎心脏发育分化密切相关,其编码的转录因子是DNA结合蛋白,具有4类高度保守的结构域,包括N端的TN(tin)结构域、160个氨基酸组成的同源盒结构域(HD)、位于HD下游的Nk2-SD和C端含有GIRAW保守的结构域。其中HD可以与目的基因中相应的启动子结合,从而启动下游基因的转录[2],Nkx2-5可与其他心脏发育转录因子如Gata4及Tbx5等相互作用共同参与心脏工作心肌的发育,调节相关离子通道和缝隙连接蛋白在心脏工作心肌的表达,Nkx2-5则处于这些调控因子的最上游。Wu等[3]通过慢病毒介导使Nkx2-5过表达于体外培养的小鼠胚胎第10天的心肌,可见Nkx2-5、Gata4及Tbx5表达均显著提高,工作心肌相关离子通道如内向整流钾通道(KCNJ2)、L型钙通道(Cav1.2)和电压敏感型钠通道(SCN5a)表达大大增加。

Nkx2-5在心脏特异性表达,虽然在其他器官也有低度表达,如发育过程中的甲状腺、咽、脾和胃等,但在出生后除心脏以外的其他器官,表达水平均显著降低[4]。在窦房结发育过程中,Nkx2-5的表达也是有一定特点的,Wiese等[5]通过研究分析鼠胚不同发育时间点窦房结的形态定位和分子分布发现,基于关键转录因子基因的不同表达,在鼠胚发育第14.5天,窦房结大体上可分为Tbx18+/Tbx3+/Nkx2-5-头部和Tbx18-/Tbx3+/Nkx2-5+尾部,尾部Nkx2-5表达相对微弱,这或许也决定了发育成熟之后的窦房结结构特点是有差异的,发育成熟的窦房结头部,密集分布着起搏细胞团,是主要的起搏区,而尾部主要包含起搏细胞、心房肌细胞和一些特化的窦房传导束。窦房结中分布的起搏细胞具有最高的自律性可产生起搏电流(If),已证实有大量细胞离子通道构成复杂的“膜时钟”和“钙时钟”两种震荡机制,从而影响起搏细胞的功能[6-7],其中超极化激活环核苷酸门控离子通道(HCN)是“膜时钟”的重要组成部分,其亚型 HCN4在窦房结中高度表达,当其变异时可引起家族性窦性心动过缓[8]。Mommersteeg等[9]研究显示胚胎发育过程中Nkx2-5可抑制HCN4的表达,且对于窦房明显边界形成是必须的,他们研究鼠胚发育过程,发现HCN4的表达区域最初是和Nkx2-5的表达区域重合的,随后其表达便限制于Nkx2-5阴性的静脉杆部分区域。研究人员通过基因工程技术产生Nkx2-5突变鼠,发现Nkx2-5阴性鼠胚的HCN4异位表达于整个心管区域,Nkx2-5低表达的鼠胚未能形成明显的窦房边界,HCN4表达广泛并延伸至心房区域,在窦房结外围的窦房传导束主要表达的缝隙连接蛋白40[10],表达量也明显减少[9]。

Nkx2-5与心房颤动(简称房颤)有一定相关性,2013年Huang等[11]通过对110名家族性房颤患者的基因测序发现与家族性房颤发生相关的杂合突变p.F145S,该突变导致的Nkx2-5转录活性降低可显著增加家族性房颤的易感性。Mommersteeg等[12]通过基因标记分析研究显示,肺静脉心肌与窦角心肌在胚胎发育过程中拥有不同发育起源,窦角心肌及其间质前体细胞不表达Nkx2-5,而肺静脉心肌起源的间质前体细胞表达Nkx2-5,Nkx2-5对于肺静脉心肌表型的维持是必须的,而Nkx2-5表达减少,可见肺静脉心肌的表型向窦角心肌表型转换,缺失缝隙连接蛋白40(Cx40)并且异位表达HCN4。这或许可部分解释Nkx2-5突变与房颤相关心肌自律性增高之间的关联性。

2 NKX2-5与窦房结发育相关转录调控因子的关系

最初的心脏发育起源于中胚层生心区,在形成心管之后,心管静脉端的静脉窦心肌与窦房结形成发育关系密切。窦房结细胞在哺乳动物胚胎中发育的具体时间尚不完全清楚,然而静脉窦心肌在窦房结占了很大一部分,在鼠胚第9.5天开始分化,第11.5天便可从形态上辨认[13]。窦房结的发育形成受一系列因素影响,其中转录调控因子的影响是不可忽视的,现在比较明确的转录因子有Tbx18,Tbx3,Shox2以及Isl1,它们的表达模式是动态且有差异的,对窦房结的发育也具有各自不同的影响,Nkx2-5与这些转录因子有着错综复杂的关系,研究也尚未完全透彻。

2.1 Tbx18 Tbx18是T-box转录因子家族Tbx1亚族中的一员,在众多调控窦房结发育的转录因子中,其处于相对上游的地位。Christoffels等[14]通过3D重建分析静脉窦窦角心肌发育过程,发现于鼠胚第9.5天时,在流入道分布的间充质细胞表达Tbx18,其末端毗邻Nkx2-5+窦角心肌,此时的Nkx2-5表达于所有c TnI+的心肌,甚至也表达于位于原始心管背侧的第二心生区Isl1+c TnI-的心脏前体细胞,发育中的窦角区存在着Nkx2-5+的心肌细胞和Tbx18+的前体细胞。自鼠胚第9.5天始,Tbx18+Nkx2-5-的前体细胞在窦角发育中开始起越来越重要作用,Nkx2-5的缺失可阻止心房基因在窦角的异位表达,而研究显示Tbx18对于静脉窦窦角和窦房结头部的形成是必须的,其缺失会导致窦角形成障碍和头部缺失,但是不影响窦房结尾部形成和起搏活动[5,14]。此外,Wiese等[5]还通过基因示踪技术研究显示窦房结头部的大部分细胞来自于Tbx18+的前体细胞。培养来自生心区后部间充质的Tbx18+细胞,可见其能够分化为具有自律性和起搏细胞特征的HCN4+细胞。Kapoor等[15-16]研究发现Tbx18在抑制与工作心肌相关的缝隙连接蛋白43和基因的表达方面有重要作用,他们将转录因子Shox2、Tbx3、Tbx5以及Tbx18分别经病毒转染乳鼠心肌细胞,结果显示Tbx18不需要其他细胞因子参与便可实现向起搏样细胞的诱导,产生的起搏样细胞可表现自律性并具有起搏细胞形态特点[16]。大量研究证实Tbx18有诱导细胞向起搏样细胞分化的巨大潜力,Mei等[17]将Tbx18基因导入鼠脂肪干细胞并与新生乳鼠心肌细胞共培养,发现Tbx18可促使脂肪干细胞HCN4表达增加且产生If。Chen等[18]通过沉默小鼠棕色脂肪干细胞的Tbx18,发现棕色脂肪干细胞向起搏样细胞的分化受到阻碍,Tbx3、Shox2、c TNT、HCN4和Cx30.2表达均明显降低。

目前尚无足够证据表明Nkx2-5与Tbx18之间存在转录方面的直接相互作用,Christoffels等[14]的研究显示从发育角度而言,两种转录因子似乎是不相关的,因为尚未发现两者会同时存在于同一时期的胚胎前体细胞中,同时在Nkx2-5与Tbx18突变体中,Tbx18与Nkx2-5的表达也是各自不受影响的。

2.2 Tbx3 Tbx3是T-box转录因子家族中的一员,其表达于鼠胚第8.5天时便可在心脏流入道和咽头区观测到,它与传导系统发育密切相关。在心脏发育过程中,三维重建分析显示从鼠胚第9.5天往后可见Tbx3的表达主要局限于房室流入道,窦角区和窦房结形成区等传导系统发生部位[19]。从鼠胚第10.5天之后,在右侧窦角边缘处可初见原始的窦房结表达Tbx3而不表达Nkx2-5,Nkx2-5的表达对于工作心肌标志物Cx40和Nppa的基因活动是必不可少的,可见与之相对的Nkx2-5+心肌大量表达着Cx40及Nppa[9],而Tbx3并不调控窦房结细胞生长和形态,作用主要是确保窦房结细胞受正确的基因调控。Hoogaars等[20]通过增强小鼠胚胎期Tbx3功能,发现Tbx3主要作为转录抑制物阻遏工作心肌细胞基因表达程序在窦房结中表达,从而间接促进起搏细胞基因表达程序,比如促进低传导性的Cx45、Cx30.2编码,在其缺失的情况下,窦房结形态正常,起搏细胞会失去它独特的基因表达程序,向更具有心房心肌细胞特征的方向表达。此外,Bakker等[21]通过他莫昔芬诱导转基因工程鼠使其心室肌异位表达Tbx3,实现了使之心室肌细胞向起搏样细胞的分化,Cx40、Cx43以及离子通道电压敏感型钠通道(INa)和内向整流钾电流(Ik1)基因表达水平降低。Wiese等[5]研究通过对Tbx18及Tbx3双基因和单基因突变转基因鼠胚的研究发现,Tbx3主要在窦房结功能完善中起着重要的作用,与上述Tbx18在窦房结发育中可能存在着序贯作用,主要在Tbx18参与调控窦房结尤其是头部的形成之后发挥作用,两个基因之间的作用是非同步且各自独立的。

Tbx3在窦房结发育过程中发挥重要作用,与Nkx2-5之间存在着相互抑制作用,Wu等[3]使Tbx3的条件性失活可引起Nkx2-5在窦房结中的异位激活表达,他们发现高度表达于窦房结的Baf 250a,可激活Tbx3,它们两者可与组蛋白去乙酰化酶3存在协调作用从而可抑制Nkx2-5的表达,扰乱他们三者之间的协调作用可促进窦房结中Nkx2-5的表达,从而促进工作心肌基因表达程序在窦房结中的表达。此外,他们还通过ChIP-qPCR方法证实了Tbx3可直接结合Nkx2-5启动子从而影响其表达。Mommersteeg等[9]研究表明Nkx2-5同样可抑制Tbx3的表达,缺乏Nkx2-5的胚胎可见Tbx3异位表达于整个心管,除此之外,本应明显的窦房边界也变得模糊不清,可见Tbx3和HCN4表达延伸至右房。

2.3 Shox2 Shox2从胚胎第8.5天开始出现于原始心管,胚胎第9.5天表达限于心脏的流入道区域,而后出现在静脉窦、窦房结、静脉瓣膜以及肺静脉处[22]。与Tbx3相似,其可抑制工作心肌细胞的基因表达程序,并且与Tbx18相似,对于静脉极的发育和形态发生也有重要作用。缺乏Shox2的小鼠表现胚胎期心动过缓,心静脉极发育不全以及一般在起搏细胞中被抑制基因如Nkx2-5、Cx40和Cx43等基因上调[22-23]。Feng等[24]通过使犬间充质干细胞过表达Shox2诱导出起搏样细胞,该细胞显示与窦房结发育相关基因如Tbx3、HCN4、Cx45表达水平增高,而与工作心肌细胞发育相关基因如Nkx2-5和Cx43表达水平降低。Hoffmann等[25]通过分离Shox2+/+和Shox2-/-转基因鼠的胚胎干细胞,然后促使其分化,经检测发现Shox2-/-鼠胚胎干细胞分化而来的窦房结样细胞Shox2、HCN4、Tbx18等窦房结特异性基因表达明显下调,而工作心肌标志物Nppb的表达则显著提高。

Shox2与Nkx2-5之间存在的拮抗作用可调控细胞发育方向,Ye等[26]研究显示Shox2与Nkx2-5参与调节窦房临界部位的起搏细胞与工作心肌细胞之间的平衡,Shox2与Nkx2-5共同表达于窦房结窦房交界处,一定水平Nkx2-5的表达对于窦房结尾部独特的电生理特性是必须的,Shox2水平增高可促进向起搏细胞分化,反之Nkx2-5水平增高则促进向工作心肌分化。一定水平的Nkx2-5的表达对于窦房结尾部独特的电生理特性也是必须的,然而当Nkx2-5表达缺失或减少时,Shox2促进向起搏细胞方向的分化的作用却变得很微弱,此外通过小干扰RNA(siRNA)沉默胚胎干细胞Nkx2-5表达可见起搏细胞标志物HCN4表达增加。

2.4 Isl1 Isl1属于LIM同源框基因家族,于鼠胚第9天便可表达于生心区,该转录因子对于第二心生区前体细胞分化是必要的,不同于第二心生区的其他部分在分化为心肌细胞的过程中表达量逐渐降低,它在流出道远端、房间隔,窦房结以及房室结中分化过程中一直表达Isl1[27]。Weinberger等[28]认为Isl1甚至可作为成熟窦房结的标志物。Vedantham等[29]通过RNA测序分析表明,Isl1在起搏细胞转录调控中占据着上游并发挥正性的转录调节作用,同时Liang等[30]认为Isl1在心脏发育的过程中对于起搏细胞的生存增殖以及功能的维持必不可少,Isl1至少调控着近三分之一的起搏细胞特异性基因,其构建的缺乏Isl1的鼠胚显示起搏细胞基因表达整体失调、心动过缓和窦房结畸形,对窦房结结构功能有重要作用的因子Shox2、Tbx3和 HCN4等基因表达也显著降低。

Nkx2-5可直接调控Isl1水平,进而下调分化为工作心肌细胞的Isl1转录水平。Dorn等[31]研究证明Nkx2-5可通过直接结合Isl1增强子而抑制Isl1转录活动,在小鼠胚胎干细胞中过表达Nkx2-5可抑制Isl1以及Isl1+心脏前体细胞下游相关产物表达。Ye等[26]研究显示Shox2也通过抑制Nkx2-5作用而促进Isl1表达。然而尚未有研究明确显示Nkx2-5与Isl1之间相互关系对窦房结结构和功能的影响。

3 小结

Nkx2-5在调控心脏发育分化方面具有重要作用。在窦房结发育过程中,一系列转录调控因子构成复杂的网络系统,微妙调节心肌分化方向,Nkx2-5可抑制窦房结基因如Tbx3、Shox2和Isl1的表达,而Tbx3和Shox2可以抑制Nkx2-5的表达。窦房结的发育形成受众多转录调控因子的影响,它们的表达模式是动态且有差异的,对窦房结发育的作用相当微妙[32]。目前利用转录因子重编程在模拟起搏细胞的表型和功能方面取得了一定效果,单迎光等[33]通过在在体经皮微创注射技术将Tbx18转入犬心肌,证实了利用转录因子实现生物起搏的可能性。深入了解转录因子与窦房结发育的关系对以后的研究有重要的提示作用。

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