正交试验优选天龙粉水溶性蛋白质的提取工艺

朱明珠 王 颖 邢佰颖 王集会

(山东中医药大学药学院，山东 济南 250355;*山东中医药大学实验中心，山东 济南 250355)

天龙为壁虎科动物无蹼壁虎等的全体［1］，含有多糖、蛋白质、氨基酸等多种化学成分［2］。研究发现，许多蛋白质和多肽是动物药的有效成分，其研究逐渐被人们重视。大部分蛋白质可溶于水、稀盐。蛋白质的提取方法主要有水溶液提取法、有机溶剂提取法等。本实验采用水溶液超声提取法与正交试验法优化天龙粉水溶性蛋白质的提取工艺。

1 材料与仪器

1.1 药材

天龙购自安徽亳州，经山东中医药大学生药系高德民老师鉴定为无蹼壁虎，天龙粉由山东中医药大学实验中心化学实验室自制。

1.2 试剂

牛血清白蛋白(国药集团化学试剂有限公司生产);酒石酸钾钠、硫酸铜、碳酸钠、氢氧化钠、以上试剂均为分析纯;实验用水为重蒸水;福林酚试剂(国药集团上海化学试剂有限公司生产)等。

1.3 仪器

UV9100B型可见分光光度计(北京莱伯泰科仪器有限公司);LDZ4—0.8型离心机(北京医用离心机厂);FA－1004N型电子分析天平(上海精密仪器有限公司);KQ－500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)等。

2 方法与结果

2.1 标准曲线的绘制

2.1.1 标准蛋白溶液的制备

精密称取牛血清蛋白20 mg置于烧杯中，加水溶解，转移至100 mL容量瓶中，定容，摇匀，即得0.2 mg/mL的标准蛋白溶液。

2.1.2 改良 Lowry法［3］测定蛋白质含量绘制标准曲线

精密取标准蛋白质溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置于试管中，加水至1 mL，加碱性铜溶液5 mL，摇匀，室温放置10 min后，快速加入福林酚试剂0.5 mL，摇匀，室温放置30 min后，于波长650 nm处测各样品吸光度。以标准蛋白浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到直线回归方程Y=2.865 8X+0.007 3，r=0.999 5，在0 ～0.2mg/mL范围内，线性良好。

2.2 正交试验

2.2.1 因素水平表的设计

影响天龙粉水溶性蛋白质提取的因素主要有料液比(A)、提取时间(B)、pH(C)，选取这三个因素的3个水平，采用L9(34)正交表进行试验，以水溶性蛋白质含量为指标进行评价。

表1 因素水平表Table 1 Factor and Level

2.2.2 正交试验结果

表2 正交试验表及结果Table 2 Arrangment and Results of Orthogonal Test

由表2可以看出，在所选因素水平范围内，影响天龙粉水溶性蛋白质含量提取因素的主次顺序为 C＞B＞A，最佳提取工艺条件为料液比1∶40、提取时间为20 min、pH为9，在该条件下，提取出的水溶性蛋白质含量为50.789 mg/g。

2.2.3 正交试验的方差分析

用SSe=SS空=2.200去检验各 因素的显著性。由表3可知，在所选因素水平范围内，因素C对试验结果影响显著，用*表示，A、B为次要因素。

表3 正交试验的方差分析表Table 3 Analysis of Variance

3 讨 论

作为我国传统中药，动物药用药历史悠久，活性高、疗效独特，但由于其取材于药用动物整体或其各组织、器官、代谢产物、病理产物，基原种类繁多，成分特殊、复杂［4］，对有效成分的提纯造成一定的困难。研究表明，大多数动物药的主要成分蛋白质、氨基酸是其发挥独特疗效的重要基础。本实验采用正交试验法和超声提取法优化了天龙粉水溶性蛋白质的提取条件，提高了水溶性蛋白质的提取效率，具有较好的应用前景。

［1］包华音，石俊英.正交试验优选壁虎药材多糖提取工艺［J］.辽宁中医杂志，2011，38(12):2 438 ～2 440.

［2］李雯，王国才，张晓琦等.中药壁虎化学成分研究［J］.中国中药杂志，2010，35(18):2 412 ～2 415.

［3］王颖，马明珠，王立娜等.发酵前后天龙粉水溶性活性物质含量对比研究［J］.湖南中医杂志，2016，(09):166－168.

［4］陈银芳，章常华，魏学鑫等.动物药中蛋白质、氨基酸检测分析研究进展［J］.时珍国医国药，2017，(01):186－189.