“乳癌术后方”拮抗乳腺癌三苯氧胺治疗耐药的体外实验研究

陆 清 薛晓红

（上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院乳腺病科，上海200437）

乳腺癌发病率逐年上升，目前乳腺癌的治疗主要包括手术、放化疗、内分泌治疗、靶向治疗及中医中药治疗，其中内分泌治疗是激素受体阳性乳腺癌患者重要的全身治疗手段之一。三苯氧胺（又名他莫昔芬，tamoxifen，TAM）是绝经前激素受体阳性乳腺癌患者术后辅助内分泌治疗的首选药物，但TAM耐药现象限制了疗效。前期临床研究发现，乳癌术后方能降低乳腺癌患者术后的5年复发转移率[1]，提高5年的无病生存率以及总生存率[2]。为初步探讨乳癌术后方在拮抗乳腺癌TAM耐药中的作用，本研究构建乳腺癌TAM耐药细胞株（MCF-7/TAM），予不同含药动物血清干预后，以噻唑蓝（MTT）法观察各组含药血清对MCF-7/TAM细胞株的生长抑制作用。

1 实验材料

1.1 实验细胞与动物 人乳腺癌细胞株（MCF-7）由美国ATCC细胞保存中心提供；SD大鼠由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，合格证编号：2008001667161，体重（180±20）g，雌性，12只。

1.2 药物与试剂 青霉素溶液、链霉素溶液、RPMI-1640培养基购自美国GIBCO公司；二甲基亚砜（DMSO）购自上海久亿化学试剂有限公司；噻唑蓝（MTT）购自美国AMRESCO公司；TAM由复旦复华药业有限公司生产，批号：161201；乳癌术后方（黄芪、党参、炒白术、茯苓、南沙参、枸杞子、仙灵脾、肉苁蓉、巴戟天、石见穿、莪术、蜂房），药物饮片来源于上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院中药房。

1.3 仪器 超净工作台（苏州净化）；二氧化碳（CO2）培养箱（日本三洋公司）；生物倒置显微镜（日本奥林巴斯公司）；台式低速离心机（上海医疗器械股份有限公司医疗设备厂）；通风橱（苏州亿达公司）；流式细胞仪（美国BD公司）；振荡器（上海沪西分析仪器厂）；立式压力锅（上海博讯公司）；电热鼓风干燥箱（上海圣欣公司）；分析天平（德国赛多利斯公司）；酶标仪（北京百泰克生物技术有限公司）；紫外光度仪、分光光度计（日本岛津公司）；高速冷冻离心机（德国艾本德公司）；台式恒温振荡器（上海精宏实验设备有限公司）。

2 实验方法

2.1 建立耐TAM细胞株（MCF-7/TAM） 人乳腺癌细胞MCF-7在常规加有10%进口胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的RPMI-1640培养基中，37℃恒温、5%CO2培养。以终浓度为5×10-6mol/L的TAM培养基冲击处于对数生长期的MCF-7细胞，培养24h后弃去含药培养基，胰酶消化，以1×105/mL细胞浓度接种于新培养瓶中，次日换液，待其逐渐长至70%～80%满瓶时再次冲击，如此反复冲击，持续培养6个月以上，并同时进行抗药性检测，反复冻存、复苏、观察细胞株的稳定性。

2.2 MTT法检测细胞耐药性 细胞消化、计数，配制成浓度为3×104个/mL的细胞悬液，96孔细胞培养板中每孔加入100μL细胞悬液（每孔3×103个细胞）。96孔细胞培养板置于37℃、5%CO2培养箱中培养24h，用完全培养基稀释TAM至所需浓度，每孔加入100μL相应的含药培养基，同时设立阴性对照组、阳性对照组。96孔细胞培养板置于37℃、5%CO2培养箱中培养72h，进行MTT染色，λ=490nm，测定OD值，计算各组抑制率。通过各组抑制率应用SPSS 17.0概率单位加权回归法计算半抑制浓度（IC50）。

2.3 制备大鼠含药血清 取雌性SD大鼠12只，进行卵巢去势手术。手术1周后，将大鼠随机分为对照组、TAM组、中药组和TAM+中药组，每组3只。

取乳癌术后方药物（黄芪30g，党参12g，炒白术9g，茯苓12g，南沙参15g，枸杞子15g，仙灵脾15g，肉苁蓉12g，巴戟天12g，石见穿30g，莪术30g，蜂房12g），按照人与大鼠等效剂量的换算系数为6（按照人体重60kg，大鼠0.2kg）计算，大鼠等效剂量=临床常用量（g/kg）×6。课题组前期实验证实，乳癌术后方2倍剂量对乳腺癌耐药细胞的抑制作用最佳，所以计算出的大鼠所需药物总量要乘以2。将中药按此药量配备，一起置于煎煮容器内，加相当于药材5倍量的冷水浸泡2h，煎煮30min后过滤，药渣再加3倍量的水，继续煎煮30min后过滤，合并2次中药滤液，于旋转蒸发仪上浓缩。配置TAM，0.1mg/mL。

对照组大鼠灌胃生理盐水，TAM组大鼠灌胃TAM水溶液，中药组大鼠灌胃中药煎剂，TAM+中药组大鼠灌胃TAM水溶液+中药煎剂。各药物用量均为2mL/次，2次/d，连续3d。于末次灌胃后1h，腹主动脉取血，分离血清，经56℃、30min灭活后，过滤除菌，-80℃保存。

2.4 MTT法测定各组药物对MCF-7/TAM细胞株的抑制作用 细胞消化、计数、配制成浓度为3×104个/mL的细胞悬液，96孔细胞培养板中每孔加入100μL细胞悬液（每孔3×103个细胞）；将96孔细胞培养板置于37℃、5%CO2培养箱中，次日按照组别加入相应的药物血清，然后分别培养2、4、6、8、10d；将96孔板进行MTT染色，λ=490nm，测定OD值；根据实验结果，以时间为横坐标，OD值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

2.5 统计学方法 多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用SNK法，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 MCF-7/TAM细胞系的建立及其耐药性 MCF-7细胞呈多边形，贴壁生长，2～3d传代1次；MCF-7/TAM细胞呈多边不规则形，贴壁生长，2～3d传代1次。见图1。通过MTT法测得不同浓度TAM作用下MCF-7、MCF-7/TAM的抑制率，见图2。应用SPSS 17.0通过概率单位加权回归法（Bliss法）计算IC50，得MCF-7/TAM细胞的耐药指数为8倍（见表1）。

图1 MCF-7、MCF-7/TAM细胞形态（×100）

图2 TAM对MCF-7、MCF-7/TAM体外增殖的抑制作用

表1 TAM对MCF-7、MCF-7/TAM体外增殖的半抑制浓度（IC50）及耐药指数

3.2 MTT法观察各组含药血清对MCF-7/TAM细胞株的抑制情况 以时间为横坐标，OD值为纵坐标，绘制细胞生长曲线，见图3。数据及统计学比较见表2。培养2d时，各组细胞OD值比较均无统计学差异（P＞0.05）；4d时TAM组、TAM+中药组细胞OD值明显低于对照组（P＜0.05），TAM组和TAM+中药组间比较差异无统计学意义（P=0.310），中药组与对照组比较差异无统计学意义（P=0.120）；培养6、8、10d时TAM+中药组、TAM组、中药组OD值均明显低于对照组（P＜0.05），且TAM+中药组、TAM组、中药组OD值依次增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。此结果说明随着培养时间的延长，中药逐渐发挥作用，其与TAM连用较单用药组更能抑制MCF-7/TAM细胞的生长。

图3 以时间为横坐标、OD值为纵坐标绘制的细胞生长曲线

表2 各组MCF-7/TAM细胞经不同药物处理后各时间点OD值比较

4 讨论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一[3]，每年全世界约有130万人被诊断为乳腺癌，约40万人死于该病。约50%的绝经前激素受体阳性乳腺癌患者出现对TAM的原发性抵抗，30%至40%的患者在治疗期间出现继发性抵抗[4]，大大限制了TAM的应用，不利疾病的治疗。目前认为与TAM耐药有关的机制较多[5-7]，但西医针对不同生物靶目标的抑制剂目前仍处于基础研究阶段，临床上缺乏有效的逆转TAM耐药的药物。有学者发现中药复方与TAM联合应用有协同作用[8-10]。另有学者研究发现，疏肝益肾方可抑制TAM耐药的人乳腺癌细胞株（MCF-7）的增殖[11]，增强乳腺癌耐药细胞对TAM的敏感性[12]。朴莹等[13]通过实验研究证明中药人参皂苷Rg3具有延缓乳腺癌发生TAM耐药的功效。

陆德铭教授认为，乳腺癌的发生与正气不足、邪毒留滞有关[14]，又将乳腺癌术后复发转移原因归纳为气阴两虚、冲任失调、余毒未尽，并以扶正祛邪为法则组成了乳癌术后方。方中黄芪、党参益气扶正，茯苓、白术健脾益气，南沙参、枸杞子滋阴益肾，仙灵脾、肉苁蓉、巴戟天温肾助阳，莪术、石见穿、蜂房活血解毒。全方具有益气养阴、调摄冲任、活血解毒作用。实验研究提示此方有抑制乳腺癌生长转移的作用[15]。但乳癌术后方是否通过拮抗TAM耐药提高临床疗效目前尚未有研究涉及。本研究结果发现，随着培养时间的延长，中药乳癌术后方逐渐发挥拮抗TAM耐药的作用，其与TAM联用较单用TAM更能抑制MCF-7/TAM细胞的生长，提示乳癌术后方与TAM联用对乳腺癌TAM耐药细胞株有协同作用。但本实验只进行了体外研究，下一步将建立裸鼠移植瘤模型，进行体内实验，进一步验证乳癌术后方拮抗乳腺癌TAM耐药的作用，并进行相关机制的探讨，以为中医药防治乳腺癌提供有力的依据。

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