黄芪多糖对乳腺癌细胞抑制作用实验研究

张虹 季有波(通讯作者) 孙晓琪 杨琪 冷雪

130031长春医学高等专科学校临床医学部1

130041吉林大学第二医院骨科医学中心2

130021吉林大学第一医院放射线科3

黄芪多糖(APS)是临床抗肿瘤中药黄芪的主要成分之一。研究发现，APS在体外对胃癌、肝癌、宫颈癌等恶性肿瘤有明显的抑制作用[1-3]，而APS对乳腺癌细胞增殖能力影响及其机制的报告较少。

资料与方法

实验材料：①细胞培养：人乳腺癌细胞系(MCF-7)，在含10%胎牛血清(BI)的DMEM培养基、37℃、5%CO2空气及饱和湿度条件下培养。②分组：黄芪多糖试验组：分为0.75、1.5、3 mg/mL浓度组。对照组：分为0.1 μmol/L阿霉素组(Dox)及空白对照组(加生理盐水)。③试剂：黄芪多糖为天津赛诺制药有限公司产品；DMEM培养基、胰蛋白酶为ThermoFisher产品；四甲基偶氮唑盐(MTT)为Sigma公司产品；DMSO均为美国Amresco公司产品。

实验方法：①平板克隆形成试验检测细胞的增殖：将细胞以3×102个/孔接种于24孔板，培养24 h后，试验组加入含0.75、1.5、3 mg/mL黄芪多糖的培养液，对照组仅加培养液。每组各设4个平行孔，每孔内液体终体积为500 μL。置于37℃、5%CO2的孵箱中孵育10 d。弃去培养液，用PBS(0.01 mol/L，pH 7.4)小心浸洗2次。加甲醇300 μL室温固定15 min，弃去固定液，用姬姆萨染液染色20 min，用流水缓慢洗去染色液，置于空气中干燥后计数。②MTT法检测细胞的存活率：将细胞以3×103个/孔接种于96孔板，培养24 h后，试验组加入含0.75、1.5、3 mg/mL的黄芪多糖的培养液，对照组仅为培养液。每组各设4个平行孔，每孔内液体终体积100 μL。培养24、48和72 h后，每孔加入10 μL新配制的5 mg/mL MTT溶液，37℃继续孵育4 h，弃上清加入100 μL DMSO溶解，混匀后用酶标仪，在570 nm波长测定吸收值(OD值)。肿瘤细胞存活率(%)=试验组OD值/对照组OD值×100%。③流式细胞术检测细胞周期：按照常规方法用PI染色，流式细胞仪检测细胞周期。收集不同剂量黄芪多糖作用48 h后的MCF-7细胞，70%冷乙醇固定过夜。用PBS冲洗2次，加100 μg/mL RNase，37 ℃水浴30 min降解RNA，再用PBS洗2次后，加50 μg/mL PI染液，4℃避光反应30 min。用FACSCalibur流式细胞仪Cell Quest软件收取细胞(每个样品收集1×104个细胞)，Modifit软件分析细胞中DNA含量的变化。

统计学方法：使用SPSS 19.0对数据进行统计分析，计量资料以(±s)表示，两组独立样本的均数比较采用t检验；多组样本均数采用方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验；多时间点重复测量的资料采用重复测量方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

平板克隆形成试验检测结果：不同药物浓度的黄芪多糖作用于MCF-7后的细胞克隆数组间差异具有统计学意义(F=8.063 9，P=0.000)，由此可见不同剂量组黄芪多糖对MCF-7细胞均有明显的抑制作用，其中3.00 mg/mL浓度的黄芪多糖对MCF-7细胞增殖的抑制作用最明显，见表1。

表1 黄芪多糖对MCF-7细胞增殖的抑制作用

黄芪多糖与细胞增殖的量效关系：MTT法检测结果显示，培养72 h后，随黄芪多糖浓度的增大MCF-7细胞的存活率出现明显降低，其中3.00 mg/mL浓度的黄芪多糖对MCF-7细胞的存活率影响最大，见图1。

图1 黄芪多糖抑制MCF-7细胞的量效变化

3 mg/mL的黄芪多糖抑制MCF-7细胞增殖的时程变化：3 mg/mL的黄芪多糖作用于MCF-7细胞后，细胞存活率在24、48、72 h分别为83%、51%、16%。APS组细胞存活率随时间显著减少(F=1 471.750，P=0.000)，对照组存活率随时间变化不显著(F=0.011，P=0.923)，时间和分组之间存在交互效应(F=26.303，P=0.007)，两组细胞存活率之间差异有统计学意义(F=354.357，P=0.000)。结果显示3 mg/mL的黄芪多糖对MCF-7细胞的抑制作用随时间延长而增强，见图2。

图2 黄芪多糖抑制MCF-7细胞的时程变化

黄芪多糖对MCF-7细胞周期的影响：黄芪多糖作用后，S期细胞比例减少，而G0/G1期细胞比例增加，见图3。

图3 黄芪多糖对MCF-7细胞周期的影响

讨 论

乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤，我国每年新增乳腺癌患者约20万[4]。得益于乳腺癌诊断技术的进步和新治疗策略的普及，越来越多的患者得以早发现、早诊断、早治疗，该病死亡率有了显著的下降[5]，但是同其他恶性肿瘤一样，辅助化疗带来的不良反应仍是困扰医生和患者的重要问题，对改善乳腺癌患者治疗后的生活质量依然十分关键[6]。

黄芪是一味常见的中药，是补虚中药的代表，具有扶正固本、补中益气的作用。现代医学研究证实，黄芪可以增强机体免疫力、减轻化疗的不良反应、显著提高患者的生存质量[7]。近年来肿瘤生物免疫治疗研究逐渐深入，国内外学者均认为在肿瘤放化疗及手术治疗的同时，应同时采取措施增强患者的免疫功能，降低化疗对各器官的损伤，从而提高患者的生存质量[8]。方晓松等使用黄芪多糖注射液联合一般化疗治疗中晚期原发性肝癌[9]，结果显示，APS可以提高患者的免疫功能、降低主要脏器的损伤，并且联合治疗组的肿瘤控制效果显著优于普通化疗组，具有良好的应用前景。

赵莲华等体外研究指出[10]，APS可抑制肝癌Bel-7404细胞系的增殖，并且与顺铂联合应用可加强对肿瘤细胞的杀伤作用。本研究得到类似结果，发现其对MCF-7细胞具有生长抑制作用，但效果不及阿霉素，其浓度、作用时间均与抑制作用呈正相关。然而，许杜娟等研究发现[11]，APS在体外对肿瘤细胞没有生长抑制效果，但在小鼠腹腔巨噬细胞培养基中加入APS培养48 h后，其上清可显著抑制肿瘤细胞的生长；进一步的研究发现，加入APS的小鼠腹腔巨噬细胞培养上清中TNF-α和IFN-γ的浓度显著增加。因此，有学者认为APS不是直接发挥抗肿瘤作用的，而是通过上调表达TNF-α和IFN-γ等免疫因子，增强机体的抗肿瘤免疫功能实现的。笔者认为，体外试验不能完全代替体内情况，但APS在肿瘤端粒酶活性、信号转导、细胞周期以及上调TNF-α和IFN-γ的表达等方面对继续深入研究有一定的启示[12]。

细胞周期失控是恶性肿瘤的主要特征之一[13]，细胞在增殖、分化和凋亡方面的异常都参与了肿瘤的发生和发展，基于此，我们研究了黄芪多糖对肿瘤细胞周期的影响。结果显示，黄芪多糖使S期细胞比例减少，而G0/G1期细胞比例增加。与巢蕾等在APS作用于胃癌细胞系MKN45的研究结果类似[14]。提示黄芪多糖抑制MCF-7细胞系增殖主要是依靠对肿瘤细胞由G1期进入S期的阻滞作用，使进入S期的细胞减少，从而延缓细胞周期进程，减慢细胞的增殖速率。

综上所述，黄芪多糖对人乳腺癌细胞有显著的生长抑制作用，这种作用随药物浓度和时间的增加而加强，诱导细胞周期阻滞于G0/G1期可能是其机制之一。

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[14]巢蕾,周杰,朱萱萱,等.黄芪多糖对人胃癌细胞系MKN45的生长抑制作用及细胞周期的影响[J].中华中医药学刊,2012,30(11):2474-2477.