肿瘤患者血小板对肝癌细胞系Bel- 7402增殖和多药耐药蛋白ABCC4的影响

周雅君，时 菁，肖 亮，田 耕，周汉新，高国全

(1.中山大学 中山医学院，广东 广州 510000； 2.深圳市第二人民医院 中心实验室， 广东 深圳 518000)

肿瘤患者血小板对肝癌细胞系Bel- 7402增殖和多药耐药蛋白ABCC4的影响

周雅君1,2，时 菁2，肖 亮2，田 耕2，周汉新2，高国全1*

(1.中山大学 中山医学院，广东 广州 510000； 2.深圳市第二人民医院 中心实验室， 广东 深圳 518000)

血小板与炎性反应的发展，肿瘤的血管生成、肿瘤的转移等密切相关[1]。多药耐药相关蛋白4(multidrug resistance-asscociated protein 4, ABCC4，MRP4)，是一种ABC(ATP-binding cassette trasporter)转运蛋白。ABCC4的高表达与肿瘤细胞的增长和恶性程度密切相关[2]，但肿瘤患者血小板与ABCC4的相关性尚不清楚，本文拟探讨肿瘤患者的血小板对肿瘤细胞增殖和ABCC4表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 血小板来源：随机选取三名正常健康人(control)、40～60岁男或女性未化疗(NCP)(肺癌、乳腺癌)和化疗(CP)(肺癌、子宫内膜癌，不论化疗疗程，化疗1年内)的肿瘤患者抽血制血小板(该研究已获得本单位伦理委员会的批准及受试者签署的知情同意书)。

1.1.2 细胞系：人肝癌细胞Bel- 7402(中科院上海细胞库)

1.1.3 药物与试剂：高糖DMEM培养基和胎牛血清(Hyclone公司)；CCK- 8试剂盒(联科生物技术有限公司)；兔抗人ABCC4单克隆抗体(Cell Signaling Technology公司)；ECL化学发光显色试剂盒(Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：37 ℃、5% CO2饱和湿度条件下，10%胎牛血清的高糖DMEM培养液培养人肝癌细胞Bel- 7402，观察细胞增殖情况，每2 d传代1次，取对数期细胞用于实验。

1.2.2 血小板提取方法：0.38 %的枸橼酸钠抗凝管采血，Tyrode缓冲液稀释后200×g离心，取上层液体1 000×g离心，制成3.0×108个/mL的洗涤血小板，备用。

1.2.3 CCK- 8检测细胞增殖：对数期细胞Bel- 7402接种至96孔板(4×103个/孔)，细胞贴壁后加入3.0×107个/孔的正常健康人群血小板(normal people platelet, NPP)、未化疗肿瘤患者血小板(no chemotherapy patient platelet, NCP)和化疗的肿瘤患者血小板(chemotherapy patient platelet, CP)，分别孵育24和48 h，弃血小板后加入10 μL CCK- 8反应液，孵育1 h，酶标仪测定各组在450 nm处吸光度值(A450)。

1.2.4 Western blot检测ABCC4蛋白的表达：对数期细胞Bel- 7402接种至6孔板(106个/孔)，细胞贴壁后加入NPP、NCP和CP(3.0×108个/mL)，共孵育24 h，弃血小板，孔内细胞裂解，制蛋白样品。BCA法测定蛋白浓度。30 ng/孔蛋白样品上样，分离、转膜、封闭、一抗二抗孵育、显色、分析。

2 结果

2.1 正常健康人、未化疗和化疗患者组对Bel- 7402细胞增殖的影响：无论化疗与否，肿瘤患者血小板均能促进Bel- 7402细胞的增殖(P<0.001)(图1)。

*P<0.001 compared with control and NPP图1 不同人群血小板对Bel- 7402细胞增殖的影响Fig 1 Effect of the platelet on proliferation of

2.2 不同患者人群血小板同Bel- 7402孵育后对ABCC4蛋白表达的影响:CP组ABCC4的表达较NPP和NCP组的血小板显著增加(P<0.05)(图2A)。无论是否经历过化疗，肿瘤患者的血小板均可使肿瘤细胞ABCC4的表达增高(P<0.05)(图2B)。

A.expression of ABCC4 in different populations; B.expression of ABCC4 in Bel- 7402;*P<0.05 compared with control and normal people group

3 讨论

肿瘤细胞与血小板之间相互作用是肿瘤转移的关键因素[3]。ABCC4是新近关注较多的多药耐药相关蛋白，研究表明其对肿瘤细胞的增殖具有重要作用[4]。本研究发现肿瘤患者血小板促人肝癌Bel- 7402细胞增殖，其机制可能与血小板释放某些促肿瘤细胞增殖的因子相关。本研究发现化疗肿瘤患者血小板ABCC4表达增加，而未化疗肿瘤患者同正常健康人血小板ABCC4蛋白表达无差异，为血小板与肿瘤多药耐药相关性提供了新的切入点。另外，实验研究发现人肝癌Bel- 7402细胞ABCC4蛋白表达增多，提示人肝癌Bel- 7402细胞ABCC4蛋白表达同肝癌细胞的增殖具有相关性。

[1] Leslie M. Cell biology. Beyond clotting: the powers of platelets[J]. Science, 2010, 328: 562- 564.

[2] Fletcher JI, Haber M, Henderson MJ,etal. ABC transporters in cancer: more than just drug efflux pumps[J]. Nat Rev Cancer, 2010, 10: 147- 156.

[3] Jain S, Harris J, Ware J. Platelets: linking hemostasis and cancer[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2010, 30: 2362- 2367.

[4] Zhao X, Guo Y, Yue W,etal. ABCC4 is required for cell proliferation and tumorigenesis in non-small cell lung cancer[J]. Onco Targets Ther, 2014, 7: 343- 351.

2016- 10- 31

2017- 03- 21

深圳市科技计划项目(JCYJ20140414170821259)；深圳细胞生物技术转化医学重点实验室(2DSY20130531165409949)

*通信作者(correspondingauthor)：gaog91@foxmail.com

1001-6325(2018)01-0093-02

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