结肠癌组织中ERRα和ERRβ的表达水平及其临床意义*

刘海宏，石刚，张睿

[1.东北大学医院 外科，辽宁 沈阳 110004；2.中国医科大学肿瘤医院（辽宁省肿瘤医院），结直肠外科，辽宁 沈阳 110042]

结肠癌组织中ERRα和ERRβ的表达水平及其临床意义*

刘海宏1，石刚2，张睿2

[1.东北大学医院 外科，辽宁 沈阳 110004；2.中国医科大学肿瘤医院（辽宁省肿瘤医院），结直肠外科，辽宁 沈阳 110042]

目的检测结肠癌组织中雌激素相关受体α（ERRα）和ERRβ的表达水平，分析其与结肠癌临床病理特征的关系，并探讨其临床意义。方法选取手术切除的结肠癌组织及其癌旁正常结肠组织标本各63例，采用免疫组织化学法检测ERRα和ERRβ蛋白阳性表达，观察其与结肠癌临床病理特征的关系，探讨两者相关性。结果ERRα和ERRβ蛋白表达于结肠癌及癌旁组织细胞核，在癌组织中高表达，癌旁组织中弱表达，结肠癌组织中ERRα和ERRβ蛋白的阳性表达率高于癌旁组织（P＜0.05）。ERRα和ERRβ蛋白的阳性表达与肿瘤浸润深度、远处转移、血管浸润、TNM分期及肿瘤分化程度有关（P＜0.05）。Spearman rank相关分析结果显示，结肠癌组织中ERRα与ERRβ蛋白的阳性表达率呈正相关（P＜0.05）。结论ERRα和ERRβ在结肠癌组织中高表达，与结肠癌不良预后临床病理特征具有相关性，两者可能共同调控结肠癌的恶性行为。

结肠癌；ERRα；ERRβ

结直肠癌在发达国家和发展中国家呈发病率逐年上升的趋势，是常见的消化系统恶性肿瘤之一[1]。在我国，结肠癌占恶性肿瘤第3位，死亡率占恶性肿瘤第2位。结直肠癌从正常上皮到恶变需经历不典型增生、腺瘤、原位癌及进展期癌等阶段[2]。不同阶段均有特异性分子事件发生，是多基因参与的过程。对肿瘤发生相关基因及因子分子的深入研究是未来结直肠癌预防和治疗重要的理论依据[3]。雌激素相关受体（estrogen receptor related receptor，ERR） 由α、β、γ 3种亚型组成[4]。有研究显示，ERR在子宫内膜癌、卵巢癌、食管癌及乳腺癌中高表达，是预后差的标志物[5]。本研究对结肠癌组织中ERRα和ERRβ的表达水平进行检测，分析其与结肠癌临床病理特征的关系，为进一步研究ERRα和ERRβ在结肠癌恶性行为中的作用建立实验基础。

1 资料与方法

1.1 材料

选取2014年1月-2015年12月在东北大学医院外科和中国医科大学肿瘤医院结直肠外科行手术切除的结肠癌患者63例，分别取癌组织及相应癌旁组织标本石蜡包埋。ERRα多克隆抗体、ERRβ多克隆抗体及免疫组织化学SP法试剂盒购自美国Santa Cruz公司。

1.2 免疫组织化学法

采用免疫组织化学法检测结肠癌及癌旁组织中ERRα和ERRβ蛋白的表达。将石蜡按4μm厚度进行切片，60℃烤箱内烘烤2 h后依次脱水、脱蜡及抗原修复，3%双氧水H2O250 ml洗涤后于37℃烤箱烘干25 min，采用PBS洗涤3次。加入1∶500稀释倍数的一抗，置入湿盒中4℃孵育过夜。室温复温20 min后PBS洗涤3次，加二抗37℃下孵育30 min，二氨基联苯胺显色后苏木素复染10 min、流水洗净，盐酸酒精进行20 s分化，再次洗涤30 min，脱水透明，应用二甲苯中性树胶进行封片。采用已知小肠组织中ERRα和ERRβ蛋白阳性表达为阳性对照，PBS代替一抗为阴性对照。由2位高年资病理医师用双盲法进行评估结果。在400倍显微镜下，每张切片随机选取5个视野，每视野上计数100个细胞，计算阳性细胞百分比。阳性细胞百分比＜10%为0分，10%～24%为1分，25%～49%为2分，50%～74%为3分，≥75%为4分；染色强度评分：无着色为0分，浅黄色为1分，黄或深黄色为2分，褐或棕褐色为3分；两者相加＞2分为阳性表达。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0统计软件，计数资料以率（%）表示，比较用χ2检验，ERRα与ERRβ的相关性分析用Spearma rank法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ERRα和ERRβ蛋白的表达

ERRα和ERRβ蛋白表达于结肠癌及癌旁组织细胞核，在癌组织中表达较强，癌旁组织中表达较弱（见附图）。结肠癌组织中ERRα和ERRβ蛋白阳性表达率与癌旁组织比较，差异有统计学意义（P＜0.05），结肠癌组织高于癌旁组织（见表1）。

附图 ERRα和ERRβ蛋白的表达 （免疫组织化学法×400）

表1 结肠癌及癌旁组织中ERRα、ERRβ蛋白阳性表达率比较 [n =63，例（%）]

2.2 ERRα、ERRβ蛋白阳性表达与结肠癌临床病理特征的关系

结肠癌组织中ERRα、ERRβ蛋白阳性表达与患者年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤直径、淋巴结转移、病理分型、病理类型无关，而与肿瘤浸润深度、远处转移、血管浸润、TNM分期及肿瘤分化程度有关（P＜0.05）。见表2。

表2 ERRα、ERRβ蛋白阳性表达与结肠癌临床病理特征的关系 例（%）

2.3 ERRα与ERRβ蛋白表达的相关性

Spearman rank相关分析结果显示，结肠癌组织中ERRα与ERRβ蛋白的阳性表达率呈正相关（rs=0.309，P=0.017）。

3 讨论

结直肠癌的发生、发展、浸润及转移等过程是多基因、多阶段的过程[6]。ERR是一种细胞核受体，调节细胞的代谢过程，尤其在高能量需求细胞内，ERR表达活跃[7]。最近研究表明，ERR与恶性肿瘤的进展具有相关性，在乳腺癌、神经母细胞瘤、前列腺癌、卵巢癌、肉瘤等肿瘤中高表达，与肿瘤患者的不良预后相关[8-9]。而且，在ERR阳性表达的乳腺癌等恶性肿瘤细胞中，肿瘤对化疗药物耐药发生率较高。

本研究结果显示，ERRα和ERRβ蛋白表达于结肠癌及癌旁组织细胞核，在癌组织中表达较强，癌旁组织中表达较弱，ERR在癌组织中表达水平高于癌旁组织，表明ERR可能参与结肠癌恶变过程或恶性肿瘤的某些生物学行为。有研究显示，在结肠癌及正常结肠组织中有ERRα mRNA表达，可以检测到ERRα转录；ERRα蛋白在结肠癌组织中的表达受到调控。本研究结果进一步显示，结肠癌组织中ERRα、ERRβ蛋白阳性表达与患者年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤直径、淋巴结转移、病理分型、病理类型无关，而与肿瘤浸润深度、远处转移、血管浸润、TNM分期及肿瘤分化程度有关，表明ERR可能与结肠癌恶性行为具有相关性，ERR高表达提示肿瘤浸润更深，远处转移概率更大，分期更高，分化更差，可能预示着结肠癌的不良预后[10]。在TNM Ⅱ～Ⅳ级结肠癌组织中，ERRα表达量高于癌旁组织，说明ERRα可能参与结肠癌的发生、发展等恶性行为。多项研究表明，ERRα高表达的乳腺癌细胞浸润、迁徙及增殖能力均高于ERRα阴性表达细胞，ERRα高表达提示患者更短的生存期及不良预后[11]。ERRα及ERRβ具有与ERRα相同或者相似的结构域。有研究显示，ERRα与ERRα识别的靶序列具有严格特异性，少部分基因既可被ERRα调控又可被ERRα调控，在这部分基因中两者具有同样的结合位点，并作用于同一调控区的不同调控位点，因此，ERR在结肠癌中可能与ERRα发挥相同或相似的作用[12]。本研究结果显示，结肠癌组织中ERRα与ERRβ蛋白的阳性表达率呈正相关，表明结肠癌中不同亚型ERR可能均参与其作用，但两者具体的作用机制需进一步实验证实。以往对ERR的研究集中在乳腺癌及卵巢癌等与内分泌密切相关的肿瘤，但ERR在消化系统恶性肿瘤的浸润、转移及进展过程中可能也发挥重要调控作用。近年来，对于肿瘤化疗药耐药性方面的研究不断深入，ERR是否对结肠癌细胞化疗耐药具有调控作用，也逐渐受到关注[13]。BERNATCHEZ等[14]研究认为，在浸润及转移性强的结肠癌细胞中，ERRα能促进离体结肠癌细胞的增殖及癌巢的形成，这可能与肿瘤细胞的高代谢要求有关，肿瘤细胞的高代谢需求促进ERRα的过表达，使肿瘤细胞分化及增殖加速。ERRα下调的离体肿瘤细胞会出现明显G1～S期的延迟，削弱了肿瘤细胞的增殖能力。HU等[13]的研究结果也在蛋白水平证明ERRα及ERRβ与结肠癌的相关性，但相关的分子生物学机制需进一步实验研究。

总之，ERRα和ERRβ在结肠癌组织中高表达，并与结肠癌浸润、转移及TNM分期等临床病理特征具有相关性，提示结肠癌预后不良，两者可能对结肠癌的恶性行为具有调控作用。ERRα和ERRβ可能作为结肠癌预后的标志物或预后因素，也可能作为靶向治疗的候选靶点。

[1]CHOW C J, AL-REFAIE W B, ABRAHAM A, et al.does patient rurality predict quality colon cancer care: a population-based study[J].dis Colon Rectum, 2015, 58(4): 415-422.

[2]AUDET-WALSH É, GIGUÉRE V. The multiple universes of estrogen-related receptor α and γ in metabolic control and relateddiseases[J]. Acta Pharmacol Sin, 2015, 36(1): 51-61.

[3]LOPEZ N E, PETERSON C Y. advances in biomarkers: going beyond the carcinoembryonic antigen[J]. Clin Colon Rectal Surg, 2016, 29(3): 196-204.

[4]HUSS J M, GARBACZ W G, XIE W. Constitutive activities of estrogen-related receptors: transcriptional regulation of metabolism by the ERR pathways in health anddisease[J]. Biochimica Et Biophysica Acta, 2015, 1852(9): 1912-1927.

[5]PARK W C. Role of ovarian function suppression in premenopausal women with early breast cancer[J]. J Breast Cancer, 2016, 19(4): 341-348.

[6]BURZ C, AZIZ B Y, BĂLĂCESCU L, et al. Tumor markers used in monitoring the tumor recurrence in patients with colorectal cancer[J]. Clujul Med, 2016, 89(3): 378-383.

[7]SKRZYPCZAK M, KAPKA-SKRZYPCZAK L, CYRANKA M, et al. Nuclear estrogen receptors co-activation mechanisms[J]. Curr Med Chem, 2013, 20(27): 3317-3338.

[8]CHANTALAT E, BOUDOU F, LAURELL H, et al. The AF-1-deficient estrogen receptor ERα46 isoform is frequently expressed in human breast tumors[J]. Breast Cancer Res, 2016, 18(1): 123.

[9]EHINGER A, MALMSTRÖM P, BENDAHL P O, et al. Histological grade provides significant prognostic information in addition to breast cancer subtypesdefined according to St Gallen 2013[J]. Acta Oncol, 2017, 56(1): 68-74.

[10]NIV Y. Estrogen receptor β expression and colorectal cancer: a systematic review and meta-analysis[J]. Eur J Gastroenterol Hepatol, 2015, 27(12): 1438-1442.

[11]WU Y M, CHEN Z J, LIU H, et al. Inhibition of ERR α suppresses epithelial mesenchymal transition of triple negative breast cancer cells bydirectly targeting fibronectin[J]. Oncotarget. Oncotarget, 2015, 6(28): 25588-255601.

[12]FEHSEL K, SCHIKOWSKI T, JÄNNER M, et al. Estrogen receptor beta polymorphisms and cognitive performance in women: associations and modifications by genetic and environmental influences[J]. J Neural Transm (Vienna), 2016, 123(12): 1369-1379.

[13]HU T, LI Z, GAO C Y, et al. Mechanisms ofdrug resistance in colon cancer and its therapeutic strategies[J]. World J Gastroenterol, 2016, 22(30): 6876-6889.

[14]BERNATCHEZ G, GIROUX V, LASSALLE T, et al. ERR α metabolic nuclear receptor controls growth of colon cancer cells[J]. Carcinogenesis, 2013, 34(10): 2253-2261.

Expressions of ERRα and ERRβ in colon cancer tissue and their clinical significance*

Hai-hong Liu1, Gang Shi2, Rui Zhang2
(1.department of Surgery, Hospital of Northeastern University, Shenyang, Liaoning 110004, China; 2.department of Colorectal Surgery, Liaoning Cancer Hospital and Institute, Shenyang, Liaoning 110042, China)

ObjectiveTodetect the expressions of estrogen-related receptor α (ERRα) and ERRβ in colon cancer, evaluate their relationships with the clinicopathological characteristics anddiscuss the clinical significance.MethodsColon cancer tissues and para-cancerous normal tissues were selected from 63 patients. Western blot was used todetect the expressions of ERRα and ERRβ and their correlations with clinicopathological characteristics were observed.ResultsERRα and ERRβ were expressed in the nuclei of the colon cancer tissues and the para-cancerous tissues, high expression was observed in the cancer tissues and low expression was seen in the para-cancerous tissues. The positive expression rates of ERRα and ERRβ in the colon cancer tissues were higher than those in the para-cancerous tissues (P＜ 0.05). The positive expressions of ERRα and ERRβ proteins were correlated with thedeepth of tumor invasion,distant metastasis, blood vessel in filtration, TNM stage and tumor differentiation (P＜ 0.05). Spearman rank analysis showed the positive expression rates of ERRα and ERRβ proteins were positively correlated (P＜ 0.05).ConclusionsERRα and ERRβ are highly expressed in colon cancer tissues and correlated with the clinicopathological characteristics of poor prognosis. They may modulate the malignant behavior of colon cancer together.

colon cancer; estrogen-related receptor α; estrogen-related receptor β

10.3969/j.issn.1005-8982.2018.02.007

1005-8982（2018）02-0037-05

R735.8

A

2016-12-15

国家自然基金（No：81672427）

张睿，E-mail：bluesky2016@aliyun.com；Tel：02486309876

（童颖丹 编辑）