固相萃取—高效液相色谱法测定烤烟中角鲨烯含量

董丽红+韦建玉+胡亚杰+陈泽鹏+张功营+万树青

摘要：通过优化提取剂、提取方法、净化剂等前处理方法和色谱条件，建立了烤烟中角鲨烯含量测定的SPE-HPLC方法。烤烟样品用三氯甲烷超声提取40 min，硅胶柱净化，高效液相色谱仪[检测波长：210 nm；流动相：甲醇/乙腈=75/25（V/V）]检测，可以准确地测定烤烟中角鲨烯含量；角鲨烯浓度在0.5～10 mg/L 范围内线性关系良好（r=0.9976）。方法的检出限（S/N=3）为 0.12 mg/L，定量限（S/N=10）为 0.39 mg/L，平均加标回收率为 88.12%。利用该方法对5个不同地区的同品种烤烟中角鲨烯含量进行测定的结果表明，不同地区的烤烟中角鲨烯含量有所差异。该方法准确度高、重现性好，可用于烤烟中角鲨烯的含量测定。

关键词：烤烟；角鲨烯；固相萃取；高效液相色谱仪

中图分类号：S572文献标识号：A文章编号：1001-4942（2017）12-0130-05

Abstract A SPE-HPLC method to determinate squalene in flue-cured tobacco was established by optimizing the chromatographic conditions and pretreatment method （extractant， extraction method and purification agent）. After validation， the method was used to measure the squalene in flue-cured tobacco from five different areas. Flue-cured tobacco samples were extracted by trichloromethane for 40 minutes and purified with the silica gel column. And the squalene content in samples was detected by the high performance liquid chromatograph （detection wavelength： 210 nm； mobile phase： methanol/acetonitrile = 75/25（V/V））. The squalene concentration showed a good linear relationship in the range of 0.5～10 mg/L （r=0.9976）. The limit of detection （LOD） and the limit of quantification （LOQ） of established method were 0.12 mg/L and 0.39 mg/L， respectively. The average recovery was 88.12% at three spiked levels. The results showed that the squalene content in flue-cured tobacco from different areas was different. The established SPE-HPLC method had high accuracy and good reproducibility， which could be used for the determination of squalene in flue-cured tobacco.

Keywords Flue-cured tobacco； Squalene；Solid phase extraction； High performance liquid chromatograph

角鯊烯是一种高度不饱和的直链三萜类化合物，具有提高血红蛋白的携氧能力，促进新陈代谢，提高体内超氧化物歧化酶（SOD）活性、增强机体免疫能力、抗肿瘤等多种生理功能，是一种具有防病治病作用的生物活性物质[1-3]。角鲨烯不仅存在动物体内，在植物中的分布也十分广泛，橄榄油和棕榈油中含有较丰富的角鲨烯，但其它植物中也有角鲨烯的存在，如鼠尾草、蕨类植物、绿色藻类植物、苔藓植物及烟叶等[4-8]。

卷烟烟气中含有多种有害化合物，其中自由基具有特殊的化学结构，性质较活泼，可以参与人体的多种生化反应，诱发多种疾病，对人体危害较大[9-14]。目前，清除卷烟烟气自由基的主要方法是向烟丝和滤嘴中加入自由基清除剂，研究发现向卷烟中添加角鲨烯、番茄红素、银杏叶提取物、丁香酚、类胡萝卜素等对卷烟烟气中的自由基均有明显的清除作用，其中角鲨烯对卷烟主流烟气中自由基的清除率为35.4%～35.9%，但因技术或成本等原因真正应用到实际生产的较少[15-20]。因此，筛选和培育出含有角鲨烯的烟草品种对卷烟烟气中自由基的降低具有重要意义。

目前，角鲨烯的检测方法较多，如高效液相色谱法（HPLC）[21]、气相色谱法（GC）[22，23]、气相色谱-质谱联用法（GC/MS）[24]、液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）[25]，但应用到烤烟中角鲨烯的检测方法未见报道。因此，本研究拟建立烤烟中角鲨烯的固相萃取-高效液相色谱法，并利用该方法测定不同地区烤烟中角鲨烯的含量，以期为进一步筛选和培育含角鲨烯的烟草品种提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

烤烟（广西中烟工业有限责任公司提供）；角鲨烯对照品（纯度≥99.8%，中国药检所）；甲醇、乙腈（色谱级）；三氯甲烷、正己烷、石油醚、丙酮（分析级）；净化剂：PSA净化柱，硅胶净化柱（Welchrom公司）；0.22 μm有机微孔滤膜。endprint

高效液相色谱仪（配紫外检测器，Agilent1100，美国Agilent公司）；台秤：T-10000型，d=0.1 g[美国双杰兄弟（集团）有限公司]；电子天平：BSA224S型，d=0.1 mg[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；旋转真空蒸发器：RE52-99型（上海亚荣生化仪器厂）；真空抽滤泵：SHZ-DⅢ型（河南省巩义市予华仪器有限公司）；超声波清洗器：KQ-500型（江苏省昆山市超声仪器有限公司）；恒温水浴锅：501数显型（江苏省金坛市宏华仪器厂）；粉粹机：750T（浙江省永康市铂欧五金厂）；孔径0.45 mm（40目）筛网。

1.2 烤烟样品前处理方法

用粉碎机将烤烟样品粉碎，过40目筛网。取试样1.0 g 于50 mL具塞锥形瓶中，精确至0.1 g，向其中加入30 mL三氯甲烷，盖上塞子，超声提取40 min，抽滤，准确移取提取液12 mL旋转蒸发至近干，用12 mL正己烷充分溶解，得正己烷提取液。用10 mL正己烷对固相硅胶净化柱进行预淋洗后，将正己烷提取液缓慢加入，用10 mL正己烷洗脱，将洗脱液一并收集并旋转蒸发至近干，用2 mL乙腈溶解，过0.22 μm有机微孔滤膜，得样液。如需存放，应在4℃冰箱密封保存，并在3 d内测定。

1.3 色谱分析条件

Agilent SB-C18色谱柱（5 μm， 4.6 mm×250 mm），流动相为甲醇/乙腈（V/V）=75/25， 流速为1.0 mL/min， 柱温为30℃，紫外检测器检测波长为210 nm，进样量为10 μL。

1.4 标准溶液配制

1.4.1 标准储备液 准确称取0.10 g角鲨烯标准品，精确至0.01 g，用乙腈溶解并定容至100 mL棕色容量瓶，充分振荡溶解，配制成1 000 mg/L的角鲨烯标准母液。该标准储备液应在4℃以下保存，于72 h内使用。

1.4.2 系列标准工作溶液 准确移取5 mL标准储备液至100 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，配制成标准溶液；分别准确移取0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL标准溶液至50 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容。该系列标准工作溶液浓度依次为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/L，现用现配。

1.5 检出限与定量限

分别称取等质量的烤烟样品，向样品中依次加入不同质量浓度的角鲨烯标准工作液，以加入等质量的乙腈为本底样品对照组。按“1.2”的方法进行处理，检测后取信噪比 S/N = 3 对应的样品浓度为方法检出限（LOD），信噪比S/N =10 对应的样品浓度为方法定量限（LOQ）。

1.6 回收率与精密度

分别称取等质量的烤烟样品，向样品中分别添加 3个浓度水平的角鲨烯标准液，以加入等质量的乙腈为本底样品对照组。按“1.2”的方法进行处理，每个浓度连续重复5 次，计算回收率和变异系数。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的选择

角鲨烯为不饱和烃类，易溶于正己烷、石油醚、丙酮和三氯甲烷等有机溶剂中，试验中选择这四种溶剂作为提取剂分别对烤烟样品中角鲨烯进行提取。结果（图1）表明，以三氯甲烷为提取剂对烤烟样品中角鲨烯提取率最高，这与李冬梅等[26]不同提取方法对茶油中角鲨烯的提取率研究结果有所差异，这可能是由于角鲨烯存在于不同的基质中所造成的。

2.2 提取方法的选择

关于角鲨烯的提取方法以索氏提取法和皂化提取法居多[27， 28]，但這两种方法耗时较多、步骤复杂。为了探索简单、便捷的提取方法，本试验在以三氯甲烷为提取剂的基础上，对烤烟中角鲨烯不同提取方法（超声波辅助提取法、索氏提取法、皂化提取法、冷浸提取法）进行比较，同时对超声波辅助提取法中的超声时间对提取率的影响进行了验证。结果（图2）表明，利用超声波辅助提取法对烤烟样品超声提取40 min，提取率较其它三种提取方法高且用时较少，因此，试验中选择超声波辅助提取法（40 min）对烤烟中的角鲨烯进行提取。

2.3 净化剂的选择

烤烟样品中基质较复杂，检测样品中角鲨烯时干扰因素较多，且利用分散固相萃取法、液液萃取法等净化方法效果均不理想。在样品前处理过程中，选择利用固相萃取法对样品进行净化。试验中考察了硅胶与PSA（N-丙基乙二胺填料）两种净化柱净化效果，结果（图3、图4）表明，利用硅胶净化柱的净化效果优于PSA净化柱，因此，试验中选择利用硅胶净化柱对烤烟样品进行净化处理。

2.4 色谱柱的选择

考察了不同类型的反相色谱柱对烤烟样品的分离分析效果，并对高效液相的色谱条件进行了优化选择。烤烟样品经色谱柱Agilent HC-C8 （5 μm，4.6 mm×250 mm）检测的出峰时间比Agilent SB-C18 （5 μm，4.6 mm×250 mm）提前17 min，但Agilent HC-C8对样品检测的重现性不好且干扰较多。考虑到检测方法的准确度和重现性等因素，试验中选用Agilent SB-C18 （5 μm，4.6 mm×250 mm）作为烤烟样品的分离分析色谱柱。

2.5 标准曲线、检出限及定量限

角鲨烯系列标准溶液于高效液相色谱仪进样检测，以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，建立角鲨烯的标准工作曲线，角鲨烯的线性回归方程为y=53.013x+0.6452，相关系数r=0.9976。试验结果表明，角鲨烯浓度在0.5～10.0 mg/L范围内线性良好；分别以仪器信噪比（S/N=3，S/N=10）所对应的溶液浓度计算得出该方法的检出限（LOD）和定量限（LOQ）分别为0.12、0.39 mg/L。角鲨烯标准品和烤烟样品（净化后）的色谱图分别见图5、图6。endprint

2.6 方法的精密度

按1.2方法對样品进行前处理，在1.3的色谱条件下对待测样品进行检测分析（平行试验，n=5），检测方法的日内与日间精密度（RSD）分别为3.12%、3.46%，结果（表1）表明，该检测方法的精密度良好。

2.7 加标试验

按1.2方法对样品进行前处理，在1.3的色谱条件下对待测样品进行检测（平行试验，n=5），计算得出烤烟样品中角鲨烯的本底含量约为10.0 mg/kg。分别以烤烟样品中角鲨烯本底值的1.5倍（高）、1.0倍（中）、0.5倍（低）进行三个浓度水平添加，测定烤烟中角鲨烯的加标回收率。试验结果（表2）表明，烤烟中角鲨烯的平均加标回收率为88.12%，该检测方法回收率较好。

2.8 不同地区烤烟中角鲨烯含量测定

取5个地区的烤烟样品，按1.2方法对样品进行前处理，在1.3的色谱条件下对待测样品进行检测（平行试验，n=5），试验结果（表3）中测得不同地区烤烟中角鲨烯含量在10.0～12.9 mg/kg，不同地区由于种植环境等因素不同，烤烟样品中角鲨烯含量也有所差异。

3 结论

本研究对烤烟样品的前处理方法和高效液相色谱条件进行了优化，建立了烤烟中角鲨烯含量的固相萃取-高效液相色谱（SPE-HPLC）检测方法。该方法的线性范围为0.5～10 mg/L，回收率为84.68%～92.29%，检出限和定量限分别为0.12、0.39 mg/L。利用已确定的方法测定5个不同地区的同品种烤烟中角鲨烯含量范围为10.0～12.9 mg/kg，这可能是由于种植环境不同所造成的。该方法具有准确度高、重现性好的特点。

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